נימי חיל יתוגרפיה להנדסת רקמות לב
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
מחלות לב וכלי דם נשארת הגורם המוביל למוות בכל העולם 1. הנדסת רקמות לב טומנת בחובו הבטחה רבה כדי לספק תגליות רפואיות פורצות עם המטרות של פיתוח רקמות פונקציונליות להתחדשות לב, כמו גם מבחני מיון במבחנה. עם זאת, את היכולת ליצור מודלים באיכות גבוהה של רקמת לב הוכיחה קשה. של הלב מטריצה תאית (ECM) היא מבנה מורכב בהיקף של שני האותות ביוכימיים ויומכנית החל מיקרו לקנה המידה ננומטרי 2. לאחרונה מקומי תנאי העמסה מכאנית ואינטראקציות התא-ECM הוכרו כמרכיב חיוני בהנדסת רקמות לב 3-5.
חלק גדול מECM הלב מורכב של סיבי קולגן מיושרים עם קטרים בקנה מידה ננו שמשפיע על מבנה רקמה וצימוד אלקטרו 2 באופן משמעותי. למרבה הצער, כמה שיטות havהיה דואר מסוגל לחקות את הארגון של סיבי ECM עד לקנה המידה ננומטרי. הפיתוחים אחרונים בטכניקות nanofabrication, לעומת זאת, מאפשרים לעיצוב וייצור של פיגומי מדרגי המחקים את in vivo רמזי קשיחות מבניים ומצע של ECM בלב 6-9.
כאן אנו מציגים את הפיתוח של שני לשחזור, חסכוני, ותהליכי nanopatterning להרחבה עבור היישור התפקודי של תאי לב באמצעות פולי ביולוגית הפולימר (lactide-co-glycolide) (PLGA) 8 ופוליאוריטן (PU) פולימר מבוסס. מצע nanofabricated anisotropically אלה (ANFS) לחקות את ECM הבסיסי של רקמות מאורגנות היטב, מיושרות והוא יכול לשמש כדי לחקור את תפקידה של nanotopography על מורפולוגיה תא ותפקודו 10-14.
באמצעות אב סיליקון nanopatterned (NP) כתבנית, עובש acrylate פוליאוריטן (רשות החשמל) הוא מפוברק. עובש רשות החשמל זה משמש לאחר מכן לרשותttern הידרוג'ל PU או PLGA באמצעות סיוע UV או ליתוגרפיה בתיווך ממס כוח הנימים (CFL), בהתאמה 15,16. בקצרה, PU או PLGA מראש פולימר הוא טיפה לוותר על coverslip זכוכית ועובש רשות החשמל מונח על גבי. לCFL בסיוע UV, PU מכן נחשף לקרינת UV (λ = 250-400 ננומטר) לריפוי. לCFL בתיווך ממס, PLGA מוטבע באמצעות חום (120 מעלות צלזיוס) ולחץ (100 kPa). לאחר הריפוי, עובש רשות החשמל הוא קילף, והשאיר מאחורי ANFS לתרבית תאים. תאים ראשוניים, כגון myocytes ילוד חדרית העכברוש, כמו גם שריר לב שמקורם בתאים אנושי pluripotent גזע, יכולים להישמר בANFS 2.
Introduction
מחלות לב וכלי דם היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם ולהציג את נטל כלכלי וחברתי כבדות משקל על 1,17 מערכת הבריאות העולמי מתוח כבר. יש הנדסת רקמות לב שתי מטרות נפרדות: (1) כדי להתחדש שריר הלב פגוע לאחר מחלה או קרדיומיופתיה איסכמית או (2) ליצור מודל נאמנות גבוה של הלב במבחנת הקרנת סמים או דוגמנות מחלה.
הלב הוא איבר מורכב שחייבים לעבוד כדי לספק דם לגוף כל הזמן. מבני מינרית בצפיפות של שריר לב ורקמות התומכות מסודרים בדפוסי סליל לאורך קיר לב 18,19. הלב הוא גם בשילוב Electromechanically 20 באופן מתואם מאוד כדי להוציא דם בצורה יעילה לגוף 21. כמה מכשולים עיקריים יישארו לטפל, עם זאת, לפני העיצוב המורכב של הטבע יכול להיות סכם באופן מהימן במבחנה.ראשית, למרות ששיטות בידול cardiomyocyte חזקות תמשיך להיות מפותחות 22, hPSC-CMS עדיין תערוכת פנוטיפים ולא בשלה. מאפייני אלקטרו והמורפולוגיה להתאים באופן הדוק ביותר רמות עובריות 23. שנית, כאשר כל הזמן בתנאי תרבות מסורתיים, שניהם נגזרים תאי הגזע ושריר לב עיקרי לא יצליחו להרכיב למבני ילידים, כמו רקמות. במקום זאת, התאים הופכים לכיוון אקראי ואינו מציגים את המראה בצורת המוט התאגדו של שריר הלב מבוגר 24.
הסביבה תאית מטריקס (ECM) שבה תאי אינטראקציה משחקת תפקיד משמעותי בתהליכים תאיים רבים 11,13,25. ECM מורכב מרמזים מורכבים, מוגדרים היטב מולקולריים וטופוגרפיים המשפיעים על המבנה ותפקוד של תאים 6,26 באופן משמעותי. בתוך הלב, יישור סלולארי עוקב מקרוב סיבי ECM קנה מידה ננומטרי הבסיסית 2. ההשפעה של nanotopograph אלהרמזי iCal בתא ותפקוד רקמות, עם זאת, הוא רחוק מלהיות מובן לחלוטין. מחקרים ראשוניים של אינטראקציה תא ביולוגי בקנה מידה ננומטרי לציין את החשיבות הפוטנציאלית ואת ההשפעה של רמזים טופוגרפיים תת מיקרון לתא איתות 27, הידבקות 28-30, 31 בצמיחה, ובידול 32,33. עם זאת, בשל הקושי בפיתוח מצעי nanofabricated לשעתק וניתן להרחבה, מחקרים כאלה לא יכולים לשחזר את ההשפעות סלולריות רב היקף של המתחם בסביבת ECM vivo. בפרוטוקול זה, טכניקת nanofabrication פשוטה וחסכונית כדי לייצר פיגומי תרבית תאים מחקה יישור ECM לב סיבי ילידים מתואר, המאפשרת מגוון רחב של חקירות רומן של אינטראקציות cardiomyocyte-ביולוגי. הבנה כיצד שריר לב באינטראקציה עם סביבת ECM ננו עלולה לאפשר את היכולת לשלוט בהתנהגות סלולרית באופן הדוק יותר לחקות תפקוד רקמת ילידtion. יתר על כן, monolayers התא הוא מערכת ניסיונית פשוטה בהשוואה למבני 3D, אך עדיין מפגין התנהגות רב תאית מורכבת לחקירות מעמיקות והקרנה פונקציונלית 2,34-36. לבסוף, יכולים לשמש פיגומים כאלה כדי לשפר את תפקוד שתל סלולארי כאשר מושתלים לתוך הלב למטרות משובי 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמות לב תפקודית בוגרות חסרות לשניהם in vivo ו במבחנת יישומים של הנדסת רקמות לב. שיטות nanofabrication CFL שתוארו כאן הן טכניקות חזקות להשגת יישור סלולארי והשפעה על תפקוד רקמות מקרוסקופית עקב יכולת ההרחבה של המערכת. יכולים בקלות להיות בדוגמת שטחים גדולים ומשמשים לתרבי…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
Riferimenti
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
- Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
- Lü, J. -. M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
- Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
- Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
- Park, J., Kim, H. -. N., Kim, D. -. H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
- Kim, D. -. H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -. M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
- Kim, D. -. H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
- Kim, D. -. H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
- Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
- Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
- Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
- Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
- Mohrman, D. E., Heller, L. J. . Cardiovascular Physiology. , (2010).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
- Qian, J. -. Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
- You, M. -. H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
- Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
- Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
- Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
- Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
- Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
- Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Park, J., Bauer, S., Mark, v. o. n. . d. e. r. . K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
- Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
- Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
- Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
- Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
- Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
