心臓組織工学のためのキャピラリーフォースリソグラフィ
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
心血管疾患は世界的に1死亡の主要な原因である。心臓組織工学は、心臓再生だけでなく、in vitroスクリーニングアッセイのための機能的な組織を開発する目的で画期的な医療発見を実現するために多くの可能性を秘めています。しかしながら、心臓組織の高忠実度のモデルを作成することが困難であることが証明されている。心臓の細胞外マトリックス（ECM）は、マイクロナノメートルスケールの2に至るまでの生化学的および生体力学的信号の両方からなる複合構造体である。ローカル機械的負荷条件及び細胞-ECM相互作用は、最近、心臓組織工学3-5の重要なコンポーネントとして認識されている。
心臓ECMの大部分は有意に組織構造および電気機械結合に影響を与える2ナノスケールの直径を有する整列されたコラーゲン繊維から構成されている。残念ながら、いくつかのメソッドは、HAVEナノメートルスケールまでECM繊維の組織を模倣することができた。ナノファブリケーション技術の最近の進歩は、しかし、心の6-9でのECMのin vivoでの構造と基板の剛性の手がかりを模倣する、スケーラブルな足場の設計および製造を可能にした。
ここでは、の開発に存在する二つの再現可能な、費用対効果、および生体適合性ポリマーであるポリ（ラクチド-コ-グリコリド）（PLGA）8およびポリウレタン（PU）系ポリマーを用いて心臓細胞の機能的な位置合わせのためのスケーラブルなナノパターニングプロセス。これらの異方nanofabricated基層（ANFS）はよく組織化、整列の組織の根本的なECMを模倣し、細胞の形態と機能10から14にナノトポの役割を調査するために使用できます。
鋳型としてナノパターン（NP）シリコンマスターを使用して、ポリウレタンアクリレート（PUA）モールドが作製される。このPUAモールドは、その後、PAに使用されているそれぞれ、UV支援または溶媒媒介毛細管力リソグラフィー（CFL）、15,16を経由して、PUまたはPLGAヒドロゲルをttern。簡潔には、PUまたはPLGAプレポリマーは、ドロップガラスカバースリップ上に分注し、PUAモールドを上に置くである。 UVアシストCFLの場合、PUは、次いで硬化させるためのUV照射（λ= 250〜400 nm）に露光される。溶媒媒介性CFLについては、PLGAを、熱（120℃）および圧力（100kPaで）を用いてエンボス加工される。硬化後、PUAモールドを細胞培養のためのANFS残して、剥離される。例えば、新生仔ラット心室筋細胞、ならびにヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞のような初代細胞は、ANFS 2上に維持することができる。
Introduction
心血管疾患は、世界における罹患率および死亡率の主要な原因であり、すでに緊張した世界的な保健システム1,17上の重い社会経済的な負担を提示する。 （1）in vitroでの薬物スクリーニングまたは疾患のモデリングのための心臓の高忠実度モデルを作成する虚血性疾患又は心筋症又は（2）の後に損傷した心筋を再生する：心臓組織工学は、2つの異なる目標を有している。
心臓は体に血液を供給するために常に働かなければならない複雑な器官である。心筋細胞および支持組織の密集した層構造は、心臓壁18,19を通して螺旋パターンで配置されている。心臓はまた、電気機械的に効率的に本体21に血液を排出する高度に配位様式20に結合される。自然の複雑なデザインを確実vitroでで要約することができる前に、いくつかの主要なハードルは、しかし、対処されていない。ロバストな心筋細胞分化方法22開発され続けているが、まず、HPSC-CMはまだかなり未成熟表現型を示す。彼らの電気機械特性および形態は、最も密接に胎児のレベルを23に一致する。従来の培養条件で維持さときに、第2、幹細胞由来の心筋細胞および一次両方は、天然、組織様構造に組み立てることができない。むしろ、細胞がランダムに配向となり、大人の心筋24のバンド棒状の外観を示さない。
細胞が相互作用する細胞外マトリックス（ECM）環境では、多数の細胞プロセス11,13,25において重要な役割を果たしている。 ECMは、細胞を有意に6,26の構造及び機能に影響を与える複雑な、明確に定義された分子及び地形手がかりからなる。心の中では、携帯の位置合わせは、密接に、基礎となるナノメートルスケールのECM繊維2に従います。これらnanotopographの影響細胞および組織の機能上のiCalの手がかりは、しかし、完全には理解遠くからである。ナノメートルスケール細胞生体材料の相互作用の予備的研究は、成長31、接着28〜30、27細胞シグナル伝達のためにサブミクロン地形手がかりの潜在的な重要性と影響力を示し、分化32,33。しかし、再現性のあるスケーラブルなnanofabricated基板を開発することが困難であるため、このような研究は、 生体内のECM環境での複合体のマルチスケール細胞効果を再現することができませんでした。このプロトコルでは、天然の心臓ECM繊維の配向を模倣する細胞培養足場を製造する簡単で費用効果の高いナノファブリケーション技術は、心筋細胞、生体材料の相互作用の新規な調査の広い範囲を可能にする、記載されている。心筋細胞は、ナノスケールのECM環境とどのように相互作用するか理解することは、より密接に模倣天然組織の機能に細胞挙動を制御する能力のために可能性がありますTiONから。さらに、細胞単層は、3D構造に比べて簡略化された実験系であるが、それでも洞察に満ちた調査と機能的スクリーニング2,34-36ための複雑な多細胞挙動を示す。最後に、このような足場は、再生目的のために心臓37内に埋め込 まれた際の細胞移植片の機能を改善するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
機能的に成熟した心臓組織は、 生体内および心臓組織工学のインビトロ適用の両方のために欠けている。ここで説明するのCFLナノ加工法は、細胞の位置合わせを実現し、システムの拡張性に起因する巨視的組織機能に影響を与えるための堅牢な技術である。大きな面積を容易にパターニングし、細胞培養のために使用することができる。巨視的セルラアラインメントは生…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
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