Kapillær Force Litografi for Cardiac Tissue Engineering
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
Hjerte-og karsykdommer er fortsatt den ledende dødsårsaken i verden en. Cardiac tissue engineering har mye lover å levere banebrytende medisinske funn med mål om å utvikle funksjonelle vev for hjerte regenerering samt in vitro screening-analyser. Men, har evnen til å lage high-fidelity modeller av hjertevevet vist seg vanskelig. Hjertets ekstracellulære matrix (ECM) er en kompleks struktur som består av både biokjemiske og biomekaniske signaler fra mikro-til nanometer skala 2. Lokal mekanisk belastningsforhold og celle-ECM interaksjoner har nylig blitt anerkjent som viktige komponenter i hjerte tissue engineering 3-5.
En stor del av den hjerte-ECM-er sammensatt av sammenstilte kollagenfibre med nano-skala diameter som i vesentlig grad påvirker vevsarkitektur og elektromekanisk kopling 2.. Dessverre, hav noen metodere vært i stand til å etterligne organiseringen av ECM fibrene ned til nanometerskala. Nye fremskritt i nanofabrication teknikker, men har aktivert design og fabrikasjon av skalerbare stillaser som etterligner in vivo strukturelle og underlaget stivhet pekepinner på ECM i hjertet 6-9.
Her presenteres utvikling av to reproduserbar, kostnadseffektiv, og skalerbare nanopatterning prosesser for den funksjonelle justering av kardiale celler ved hjelp av biokompatibel polymer poly (laktid-ko-glykolid) (PLGA) 8 og en polyuretan (PU) basert polymer. Disse anisotropisk nanofabricated undergrunn (anfs) ligne den underliggende ECM av godt organiserte, justert vev og kan brukes til å undersøke hvilken rolle nanotopography på celle morfologi og funksjon 10-14.
Ved hjelp av en nanopatterned (NP) silisium mester som en mal, er en polyuretan akrylat (PUA) mold fabrikkert. Denne PUA mold blir så brukt til pattern PU eller PLGA hydrogel via UV-assistert eller løsemiddel-mediert kapillær kraft litografi (CFL), henholdsvis 15,16. Kort, PU eller PLGA pre-polymer er dråpe dispensert på en glass dekkglass og PUA form anbringes på toppen. For UV-assistert CFL, blir PU deretter eksponert for UV-stråling (λ = 250 til 400 nm) for å herde. For oppløsningsmiddel-formidlet CFL, er PLGA preget ved hjelp av varme (120 ° C) og trykk (100 kPa). Etter herding, blir PUA formen skrelles av, etterlater en anfs for cellekultur. Primære celler, slik som neonatale rotte ventrikulære myocytter, så vel som humane pluripotent stamcelle-avledet cardiomyocytes, kan opprettholdes på anfs 2..
Introduction
Hjerte-og karsykdommer er den ledende årsak til sykelighet og dødelighet i verden og presentere en tungtveiende samfunnsøkonomisk byrde på en allerede anstrengt global helse system 1,17. Hjertevev teknikk har to forskjellige mål: (1) å regenerere skadd myokardium etter iskemisk sykdom eller kardiomyopati, eller (2) for å skape en high fidelity modell av hjertet for in vitro legemiddelscreening eller sykdom modellering.
Hjertet er et komplekst organ som må arbeide hele tiden for å tilføre blod til kroppen. Tettpakkede laminære strukturer av kardiomyocytter og støttende vev er anordnet i skruelinjeformede mønstre gjennom hjerteveggen 18,19. Hjertet blir også elektromekanisk koblet 20 i en sterkt koordinert måte til effektivt å mate ut blod til legemet 21.. Flere store hindringer gjenstår å løses, men før naturens intrikate design kan sikkert bli recapitulated in vitro.Først, selv robuste cardiomyocyte differensiering metoder fortsette å bli utviklet 22, hPSC-CMS fortsatt viser heller umodne fenotyper. Deres elektromekaniske egenskaper og morfologi best mulig overens fosterets nivå 23. For det andre, da holdt i tradisjonelle kulturforhold, både stamcelle-avledet og primær cardiomyocytes ikke klarer å montere inn innfødte, vev-lignende strukturer. Snarere celler blir tilfeldig orientert og oppviser ikke den bundet stangformet utseende voksen myokardium 24..
Den ekstracellulære matrix (ECM) miljø med hvilke celler kommuniserer spiller en betydelig rolle i en rekke cellulære prosesser 11,13,25. ECM består av komplekse, veldefinerte molekylære og topografiske signaler som i vesentlig grad påvirker struktur og funksjon av celler 6,26. Innenfor hjertet, følger cellular justering tett de underliggende nanometer skala ECM fibre to. Virkningen av disse nanotopographical signaler på celler og vev-funksjon, men er langt fra fullstendig forstått. Foreløpige studier av nanometer skala celle-biomateriale samspill indikerer potensialet betydningen og virkningen av sub-micron topografiske signaler for cellesignale 27, vedheft 28-30, vekst 31, og differensiering 32,33. Imidlertid, på grunn av vanskeligheten med å utvikle reproduserbare og skalerbare nanofabricated substrater, slike studier ikke kunne reprodusere de flerskala cellulære effekter av komplekset in vivo-ECM-miljø. I denne protokollen, er en enkel og kostnadseffektiv nanofabrication teknikk for å produsere cellekultur stillaser etterligne naturlig hjerte ECM fiber innretting er beskrevet, noe som åpner for en lang rekke av nye undersøkelser av cardiomyocyte-biomateriale interaksjoner. Forstå hvordan cardiomyocytes samhandle med nanoskala ECM miljø kan tillate for evnen til å kontrollere mobilnettet atferd til nærmere etterligne innfødte vev funksjon. Videre cellemonolagene er en forenklet eksperimentelt system i forhold til 3D-strukturer, men fortsatt viser komplekse flercellede atferd for innsiktsfulle undersøkelser og funksjonell screening 2,34-36. Endelig kan slike stillaser anvendes for å forbedre celleorganfunksjon når implantert inn i hjertet for regenerative formål 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funksjonelt modne kardiale vev mangler både in vivo-og in vitro-anvendelser av hjertevev engineering. De CFL nanofabrication metoder som er beskrevet her, er robuste teknikker for å oppnå celle innretting og påvirke makroskopiske vev funksjon på grunn av fleksibiliteten til systemet. Store områder kan lett bli mønstret og brukes for cellekultur. Makroskopisk cellulær oppstilling er nødvendig i hjertevev teknikk for å lage biomimetic, funksjonelt vev så den påvirker både mekaniske og elektriske egen…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
Riferimenti
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
- Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
- Lü, J. -. M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
- Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
- Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
- Park, J., Kim, H. -. N., Kim, D. -. H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
- Kim, D. -. H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -. M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
- Kim, D. -. H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
- Kim, D. -. H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
- Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
- Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
- Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
- Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
- Mohrman, D. E., Heller, L. J. . Cardiovascular Physiology. , (2010).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
- Qian, J. -. Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
- You, M. -. H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
- Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
- Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
- Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
- Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
- Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
- Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Park, J., Bauer, S., Mark, v. o. n. . d. e. r. . K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
- Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
- Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
- Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
- Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
- Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
