Kapillärkraften Litografi för Cardiac Tissue Engineering
Summary
In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.
Abstract
Hjärt-och kärlsjukdomar är fortfarande den vanligaste dödsorsaken i världen 1. Hjärtvävnadsteknik rymmer mycket löfte att leverera banbrytande medicinska upptäckter med målen för att utveckla funktionella vävnader för hjärt-regeneration samt in vitro screeninganalyser. Däremot har förmågan att skapa hifi-modeller av hjärtvävnad visat sig svårt. Hjärtats extracellulära matrix (ECM) är en komplex struktur som består av både biokemiska och biomekaniska signaler från mikro-till nanometerskala 2. Lokal mekanisk belastningsförhållanden och cell-ECM interaktioner har nyligen fått status som viktiga komponenter i hjärtvävnad engineering 3-5.
En stor del av hjärt ECM består av anpassade kollagenfibrer med nanonivå diametrar som väsentligt utöva ett positivt inflytande vävnadsarkitektur och elektromekaniska kopplingen 2. Tyvärr har få metoder HAVe kunnat efterlikna organiseringen av ECM fibrerna ner till nanometerskala. Nya framsteg inom nanofabrikation tekniker har dock gjort det möjligt för design och tillverkning av skalbara byggnadsställningar som efterliknar vivo struktur och substrat styvhet ledtrådar för ECM i hjärtat 6-9 i.
Här presenterar vi utvecklingen av två reproducerbara, kostnadseffektiv, och skal Nanopatterning processer för den funktionella anpassningen av hjärt-celler med användning av den biokompatibla polymeren poly (laktid-sam-glykolid) (PLGA) 8 och en polyuretan (PU) baserad polymer. Dessa anisotropiskt nanofabricated substrat (ANFS) likna den underliggande ECM av välorganiserade, inriktade vävnader och kan användas för att undersöka vilken roll nanotopography cell morfologi och funktion 10-14.
Med hjälp av en nanopatterned (NP) kisel mästare som en mall, är en polyuretan-akrylat (PUA) mögel tillverkas. Denna PUA gjutform används sedan för att pattern PU eller PLGA hydrogel via UV-assisterad eller lösningsmedel-medierad kapillärkraften litografi (CFL), respektive 15,16. Kortfattat, PU eller PLGA-prepolymer är droppe dispenseras på ett täckglas och PUA gjutform är placerad på toppen. För UV-assisted CFL är PU exponerades sedan för UV-strålning (λ = 250-400 nm) för härdning. För lösningsmedelsmedierad CFL är PLGA präglade med användning av värme (120 ° C) och tryck (100 kPa). Efter härdning PUA mögel avskalas och lämnar efter sig en ANFS för cellodling. Primära celler, såsom neonatal råttventrikulära myocyter, såväl som humana pluripotenta stamceller härstammar cardiomyocytes, kan upprätthållas på ANFS 2.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste orsaken till sjuklighet och dödlighet i världen och presentera en tung socioekonomisk börda för en redan ansträngd global hälsosystem 1,17. Hjärtvävnadsteknik har två tydliga mål: (1) för att regenerera skadade hjärtmuskeln efter ischemisk sjukdom eller kardiomyopati eller (2) för att skapa en naturtrogen modell av hjärtat för in vitro drogscreening eller sjukdomsmodellering.
Hjärtat är ett komplext organ som måste ständigt arbeta för att leverera blod till kroppen. Tätt packade laminära strukturer hjärtmuskelceller och stödjande vävnader är arrangerade i spiralmönster under hela hjärtväggen 18,19. Hjärtat är också elektromekaniskt kopplade 20 i en mycket samordnat sätt för att effektivt mata ut blod till kroppen 21. Flera stora hinder kvar för att tas upp, men innan naturens intrikata utformning tillförlitligt kan rekapituleras in vitro.Först, även om robusta cardiomyocyte differentiering fortsätta att utvecklas 22 HPSC-CM fortfarande uppvisar ganska omogna fenotyper. Deras elektromekaniska egenskaper och morfologi närmast matchar fostrets nivåer 23. För det andra, när det förvaras i traditionella odlingsbetingelser, både stamcellshärledda och primära kardiomyocyter misslyckas med att montera in native, vävnadslika strukturer. Snarare celler blir slumpmässigt orienterade och uppvisar inte den bandade stavformade utseende vuxna hjärtmuskeln 24.
Den extracellulära matrisen (ECM)-miljö med vilken celler interagerar spelar en betydande roll i ett stort antal cellulära processer 11,13,25. ECM består av komplexa, väldefinierade molekylära och topografiska ledtrådar som väsentligt påverkar struktur och funktion av celler 6,26. Inom hjärta, följer cellulär anpassning noga de underliggande nanometerskala ECM fibrer 2. Effekterna av dessa nanotopographical cues på cell-och vävnadsfunktion är dock långt ifrån helt förstådd. Preliminära studier av nanometerskala cell biomaterial interaktion indikerar potential betydelsen och effekten av submikrona topografiska ledtrådar för cell signalering 27, vidhäftning 28-30, tillväxt 31, och differentiering 32,33. Men på grund av svårigheten i att utveckla reproducerbara och skalbara nanofabricated substrat, sådana studier kunde inte återge flerskaliga cellulära effekter av komplexet in vivo ECM miljö. I detta protokoll är en enkel och kostnadseffektiv nanofabrikation teknik för att producera cellodlings ställningar härma infödda hjärt ECM fiber inriktning beskrivs, vilket möjliggör ett brett utbud av nya undersökningar av cardiomyocyte-biomaterial interaktioner. Att förstå hur kardiomyocyter samverkar med nano ECM miljö kan ge utrymme för möjligheten att styra cellulärt beteende för att närmare efterlikna naturliga vävnaden funktion. Dessutom cellmonolager är ett förenklat experimentellt system jämfört med 3D-strukturer, men ändå uppvisar komplexa flercelliga beteende för insiktsfulla utredningar och funktionell screening 2,34-36. Slutligen kan sådana ställningar användas för att förbättra cellulär transplantatfunktion när de implanteras in i hjärtat för regenerativa ändamål 37.
Protocol
Representative Results
Discussion
Funktionellt mogna hjärtvävnader saknas för både in vivo och in vitro-tillämpningar av hjärtvävnadsteknik. De CFL nanofabrikation metoder som beskrivs här är robusta metoder för att uppnå cellulär anpassning och påverka makroskopisk vävnadsfunktion på grund av skalbarheten i systemet. Stora områden kan enkelt mönstrat och användes för cellodling. Makroskopisk cellulär uppriktning är nödvändigt i hjärtvävnadsteknik för att skapa biomimetiska, funktionell vävnad eftersom den p?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D. H. Kim thanks the Department of Bioengineering at the University of Washington for the new faculty startup fund. D. H. Kim is also supported by the Perkins Coie Award for Discovery, the Wallace H. Coulter Foundation Translational Research Partnership Award, the Washington State Life Science Discovery Fund, and the American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14560076). J. Macadangdang and A. Jiao thank the support from the NIH Bioengineering Cardiovascular Training Grant Fellowship. Additional support for this work comes from the National Institutes of Health (NIH) grant R01HL111197 to M. Regnier.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| NOA 76 | Norland Products, Inc. | 7606B | |
| Surface Adhesion Promotor (Glass Primer) | Minuta Tech | ||
| PUA | Minuta Tech | MINS-311RM | |
| Soft Rubber Roller | Speedball | ||
| Silicon Wafers | NOVA Electronic Materials | FA01-9900 | |
| Photoresist | Shipley | SPRT510 | |
| Photoresist Developer | Shipley | MF320 | |
| Electron-Beam Lithography System | JEOL | JBX-9300FS | |
| Etching System | Surface Technology Systems | NP10 8UJ | |
| Plasma Asher System | BMR Technology Co. | DSF-200 | |
| Ozone Cure System | Minuta Tech | MT-UV-O- 08 | |
| Fusion Cure System | Minuta Tech | MT-UV-A 11 | |
| NOA 83H | Norland Products, Inc. | 8301 | |
| Spin Coater | Laurel Technology | WS-400-6NPP | |
| Skyrol PET Film | SKC Co., Ltd. | 23038-59-9 | |
| 25mm Glass Slides | Corning | 2948 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 6/5/2553 | |
| Poly(D,L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | P2191-1G | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978-1L | |
| 500g Weights | Global Insustrial | T9FB503120 | |
| Isopropyl Alcohol | EMD Millipore | PX1835-2 | |
| Hot Plate | Corning | PC-420D | |
| Sonicator | Branson | B2510MTH |
Riferimenti
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2095-2128 (2012).
- Kim, D. -. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 565-570 (2010).
- Tulloch, N. L., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circulation Research. 109, 47-59 (2011).
- Bursac, N., Parker, K., Irvanian, S., Tung, L. Cardiomyocyte Cultures With Controlled Macroscopic Anisotropy: A Model for Functional Electrophysiological Studies of Cardiac Muscle. Circulation Research. 91, (2002).
- Fink, C., et al. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. The FASEB Journal. 14, 669-679 (2000).
- Stevens, M. M. Exploring and Engineering the Cell Surface Interface. Science. 310, (2005).
- Mark, K., Park, J., Bauer, S., Schmuki, P. Nanoscale engineering of biomimetic surfaces: cues from the extracellular matrix. Cell Tissue Res. 339, 131-153 (2009).
- Lü, J. -. M., Wang, X., Marin-Muller, C., Wang, H., Lin, P. H., Yao, Q., Chen, C. Current advances in research and clinical applications of PLGA-based nanotechnology. Expert. Rev. Mol. Diagn. 9, 325-341 (2009).
- Kim, H. N., et al. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Ann Biomed Eng. 40, 1339-1355 (2012).
- Kim, D. -. H., Provenzano, P. P., Smith, C. L., Levchenko, A. Matrix nanotopography as a regulator of cell function. The Journal of Cell Biology. 197, 351-360 (2012).
- Park, J., Kim, H. -. N., Kim, D. -. H., Levchenko, A., Kahp-Yang, S. Quantitative Analysis of the Combined Effect of Substrate Rigidity and Topographic Guidance on Cell Morphology. IEEE Trans.on Nanobioscience. 11, 28-36 (2012).
- Kim, D. -. H., Lee, H., Lee, Y. K., Nam, J. -. M., Levchenko, A. Biomimetic Nanopatterns as Enabling Tools for Analysis and Control of Live Cells. Adv. Mater. 22, 4551-4566 (2010).
- Kim, D. -. H., Wong, P. K., Park, J., Levchenko, A., Sun, Y. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 11, 203-233 (2009).
- Kim, D. -. H., et al. Nanopatterned cardiac cell patches promote stem cell niche formation and myocardial regeneration. Integr Biol. 4, 1019 (2012).
- Kim, P., et al. Fabrication of nanostructures of polyethylene glycol for applications to protein adsorption and cell adhesion. Nanotechnology. 16, 2420-2426 (2005).
- Hwang, S. Y., et al. Adhesion Assays of Endothelial Cells on Nanopatterned Surfaces within a Microfluidic Channel. Anal. Chem. 82, 3016-3022 (2010).
- Heidenreich, P. A., et al. Forecasting the Future of Cardiovascular Disease in the United States: A Policy Statement From the American Heart Association. Circulation. 123, 933-944 (2011).
- Legrice, I. J., et al. Laminar structure of the heart: ventricular myocyte arrangement and connective tissue architecture in the dog. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 269, 1-12 (2002).
- Sosnovik, D. E., Wang, R., Dai, G., Reese, T. G., Wedeen, V. J. Diffusion MR tractography of the heart. J Cardiovasc Magn Reson. 11, 47 (2009).
- Bers, D. M. Calcium Fluxes Involved in Control of Cardiac Myocyte Contraction. Circulation Research. 87, 275-281 (2000).
- Mohrman, D. E., Heller, L. J. . Cardiovascular Physiology. , (2010).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Zhang, J., et al. Functional Cardiomyocytes Derived From Human Induced Pluripotent Stem Cells. Circulation Research. 104, (2009).
- Qian, J. -. Y., Guo, L. Altered cytosolic Ca2+ dynamics in cultured Guinea pig cardiomyocytes as an in vitro model to identify potential cardiotoxicants. Toxicology in Vitro. 24, 960-972 (2010).
- You, M. -. H., et al. Synergistically Enhanced Osteogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells by Culture on Nanostructured Surfaces with Induction Media. Biomacromolecules. 11, 1856-1862 (2010).
- Kim, H. N., et al. Nanotopography-guided tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Drug Delivery Reviews. 65, 536-558 (2013).
- Mannix, R. J., et al. Nanomagnetic actuation of receptor-mediated signal transduction. Nature Nanotech. 3, 36-40 (2007).
- Karuri, N. W., et al. Biological length scale topography enhances cell-substratum adhesion of human corneal epithelial cells. J Cell Sci. 117, 3153-3164 (2007).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92, 2964-2974 (2007).
- Koo, L. Y., Irvine, D. J., Mayes, A. M., Lauffenburger, D. A., Griffith, L. G. Co-regulation of cell adhesion by nanoscale RGD organization and mechanical stimulus. J Cell Sci. 115, 1-11 (2002).
- Yim, E. K. F., et al. Nanopattern-induced changes in morphology and motility of smooth muscle cells. Biomaterials. 26, 5405-5413 (2008).
- Dalby, M. J., et al. The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater. 6, 997-1003 (2007).
- Park, J., Bauer, S., Mark, v. o. n. . d. e. r. . K., Schmuki, P. Nanosize and Vitality: TiO 2Nanotube Diameter Directs Cell Fate. Nano Lett. 7, 1686-1691 (2007).
- Entcheva, E., Bien, H. Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 92, 232-257 (2006).
- Tung, L., Zhang, Y. Optical imaging of arrhythmias in tissue culture. Journal of Electrocardiology. 39, (2006).
- Himel, H. D., Bub, G., Lakireddy, P., El-Sherif, N. Optical imaging of arrhythmias in the cardiomyocyte monolayer. Heart Rhythm. 9, 2077-2082 (2012).
- Kim, J., Hayward, R. C. Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture. Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart. Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).
- Badie, N., Bursac, N. Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure. Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).
- Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning. Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
