Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) i bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden har blitt brukt til å følge de stokastiske uttrykk dynamikken i en transkripsjon faktor, λ repressor CI<sup> 1</sup>.
Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) til bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden gjør det mulig å telle antallet av proteinmolekyler produsert en celle under sekvensielle, fem minutters tidsvinduer. Det krever en fluorescensmikroskop med laser magnetisering effekttetthet ~ 0,5 til 1 kW / cm 2, som er tilstrekkelig følsom til å detektere enkelt fluorescerende proteinmolekyler i levende celler. Den fluorescerende reporter brukes i denne metoden består av tre deler: en membran målretting sekvens, en rask modning, gul fluorescerende protein og en protease gjenkjennelsessekvens. Reporteren er translationally smeltet til N-terminus av et protein av interesse. Celler dyrkes på en temperatur-kontrollert mikroskop scenen. Hvert femte minutt, er fluorescerende molekyler i cellene avbildes (og senere counted ved å analysere fluorescens bilder) og deretter photobleached slik at bare nylig oversatte proteiner telles i neste måling.
Fluorescens bilder som følge av denne metoden kan analyseres ved å registrere fluorescerende flekker i hvert bilde, tildele dem til individuelle celler og deretter tildele celler til celle linjene. Antallet proteiner produsert innenfor et tidsvindu i en gitt celle er beregnet ved å dividere den integrerte fluorescensintensiteten av flekker med gjennomsnittlig intensitet av enkelt fluorescerende molekyler. Vi brukte denne metoden for å måle uttrykket nivåer i størrelsesorden 0-45 molekyler i enkle 5 min tidsvinduer. Denne metoden mulig for oss å måle støy i uttrykket av λ repressor CI, og har mange andre potensielle bruksområder i systembiologi.
Den CoTrAC metoden kan bli generalisert til måle produksjonen av andre proteiner hvor konvensjonelle N-eller C-terminale fluorescerende protein fusjoner kan forstyrre proteinaktivitet. Den CoTrAC strategi har tre unike fordeler fremfor dagens metoder. Først sikrer co-translasjonell fusjon som ett molekyl av den fluorescerende reporter produseres for hvert molekyl av proteinet av interesse, slik at nøyaktig telling av proteinproduksjon i sanntid. Sekund, membran målrettede reporter TSR-Venus gjør single-molekyl dete…
The authors have nothing to disclose.
Plasmidet pCG001 uttrykke Ubp1 ble vennlig levert av Rohan Baker på John Curtin School of Medical Research. Dette arbeidet ble finansiert av March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 og NSF KARRIERE award 0.746.796.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
Milli-Q H2O | |||
5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
20% glucose | |||
MgSO4 | |||
CaCl2 | |||
50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |