Enkelt-molekyl Imaging of Gene Regulation<em> In vivo</em> Ved hjelp av Cotranslational Aktivering av Cleavage (CoTrAC)

Summary

Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) i bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden har blitt brukt til å følge de stokastiske uttrykk dynamikken i en transkripsjon faktor, λ repressor CI¹.

Abstract

Vi beskriver en fluorescens mikroskopi metode, Co-Translasjonell Aktivering av Cleavage (CoTrAC) til bildet produksjon av protein molekyler i levende celler med single-molekyl presisjon uten perturbing protein funksjonalitet. Denne metoden gjør det mulig å telle antallet av proteinmolekyler produsert en celle under sekvensielle, fem minutters tidsvinduer. Det krever en fluorescensmikroskop med laser magnetisering effekttetthet ~ 0,5 til 1 kW / cm ^2, som er tilstrekkelig følsom til å detektere enkelt fluorescerende proteinmolekyler i levende celler. Den fluorescerende reporter brukes i denne metoden består av tre deler: en membran målretting sekvens, en rask modning, gul fluorescerende protein og en protease gjenkjennelsessekvens. Reporteren er translationally smeltet til N-terminus av et protein av interesse. Celler dyrkes på en temperatur-kontrollert mikroskop scenen. Hvert femte minutt, er fluorescerende molekyler i cellene avbildes (og senere counted ved å analysere fluorescens bilder) og deretter photobleached slik at bare nylig oversatte proteiner telles i neste måling.

Fluorescens bilder som følge av denne metoden kan analyseres ved å registrere fluorescerende flekker i hvert bilde, tildele dem til individuelle celler og deretter tildele celler til celle linjene. Antallet proteiner produsert innenfor et tidsvindu i en gitt celle er beregnet ved å dividere den integrerte fluorescensintensiteten av flekker med gjennomsnittlig intensitet av enkelt fluorescerende molekyler. Vi brukte denne metoden for å måle uttrykket nivåer i størrelsesorden 0-45 molekyler i enkle 5 min tidsvinduer. Denne metoden mulig for oss å måle støy i uttrykket av λ repressor CI, og har mange andre potensielle bruksområder i systembiologi.

Protocol

1. Strain Engineering arbeidsflyt Sett sekvenser koding (a) en membran-lokalisering sekvens, (b) en rask modning fluorescerende protein og (c) en protease gjenkjennelsessekvens N-terminal til og i ramme med et protein av interesse (f.eks en transkripsjonsfaktor). Vi brukte membranen målrettet TSR-Venus reporter 2 og smeltet det til protease gjenkjennelsessekvens Ubiquitin (UB) for å telle antall uttrykt bakteriofag λ repressor CI protein molekyler. Detaljer om hvordan vi konstruerte fus…

Representative Results

Typiske resultater fra en CoTrAC eksperiment sporing produksjonen av λ repressor CI er vist i figurene 4 og 5. I dette eksperimentet ble 12 kolonier avbildes på 5 min intervaller. Ved hvert tidspunkt, ble kolonien første autofocused og sentraliserte innenfor bildebehandling regionen. Deretter ble sentrert / fokusert posisjon lagres og en lysfelt bildet ble kjøpt. Scenen ble deretter translocated av ~ 0,5 mikrometer langs z-aksen for å flytte fra lysfelt fokusplan til flyet halverer…

Discussion

Den CoTrAC metoden kan bli generalisert til måle produksjonen av andre proteiner hvor konvensjonelle N-eller C-terminale fluorescerende protein fusjoner kan forstyrre proteinaktivitet. Den CoTrAC strategi har tre unike fordeler fremfor dagens metoder. Først sikrer co-translasjonell fusjon som ett molekyl av den fluorescerende reporter produseres for hvert molekyl av proteinet av interesse, slik at nøyaktig telling av proteinproduksjon i sanntid. Sekund, membran målrettede reporter TSR-Venus gjør single-molekyl dete…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Agarose (Low melting temperature)	Lonza	50100
Milli-Q H2O
5×M9 salts			Following recipe described in 9
20% glucose
MgSO4
CaCl2
50×MEM amino acid solution	Invitrogen	11130-051
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor	Bioptechs	FCS-2
Objective Heater	Bioptechs	Model depends on microscope objective
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
Micro cover glasses	VWR	40CIR-1	Can be difficult to source; also available from Bioptechs
Cover glass/slide gasket	Bioptechs	FCS2 0.75 mm
Fluorescence Microscope	Various	Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software	Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins
EM-CCD Camera	Various	Example setup: Andor Ixon DU-898	Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background