Single-molekyle Imaging af genregulering<em> In vivo</em> Brug Cotranslational Aktivering ved spaltning (CoTrAC)
Summary
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi fremgangsmåde, cotranslationel aktivering ved spaltning (CoTrAC), til billede produktionen af proteinmolekyler i levende celler med enkelt-molekyle præcision uden at forskubbe proteinets funktionalitet. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at følge de stokastiske udtrykket dynamik en transkriptionsfaktor, at λ repressor CI<sup> 1</sup>.
Abstract
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi fremgangsmåde, cotranslationel aktivering ved spaltning (CoTrAC) til billede produktionen af proteinmolekyler i levende celler med enkelt-molekyle præcision uden at forskubbe proteinets funktionalitet. Denne metode gør det muligt at tælle antallet af proteinmolekyler produceret i én celle i sekventielle, fem minutter tidsvinduer. Det kræver et fluorescensmikroskop med laserexcitation effekttæthed på ~ 0,5 til 1 kW / cm 2, som er tilstrækkelig følsom til at påvise enkelte fluorescerende protein-molekyler i levende celler. Det fluorescerende reporter, der anvendes i denne fremgangsmåde består af tre dele: en membran targeting sekvens, en fast-modning, gult fluorescerende protein og en protease-genkendelsessekvens. Reporteren er translationelt fusioneret til N-terminalen af et protein af interesse. Celler dyrkes på en temperaturstyret objektbordet. Hvert femte minut, er fluorescerende molekyler i celler afbildes (og senere counted ved at analysere fluorescensbilleder) og efterfølgende Lysblegede således at kun nyligt translaterede proteiner tælles i den næste måling.
Fluorescensbilleder som følge af denne fremgangsmåde kan analyseres ved at detektere fluorescerende pletter i hvert billede, tildele dem til individuelle celler og derefter tildele celler til cellelinier. Antallet af proteiner i et tidsvindue i en given celle beregnes ved at dividere den integrerede fluorescensintensitet af pletter med den gennemsnitlige intensitet af enkelte fluorescerende molekyler. Vi anvendte denne fremgangsmåde til at måle ekspressionsniveauer i området fra 0 til 45 molekyler i enkelt-5 min tidsvinduer. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at måle støjen i ekspressionen af λ-repressoren CI, og har mange andre potentielle anvendelser i systemer biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
The CoTrAC fremgangsmåde kan generaliseres til at måle produktionen af andre proteiner, hvor konventionelle N-eller C-terminale fluorescerende proteinfusioner kan forstyrre proteinaktivitet. Den CoTrAC strategi har tre unikke fordele i forhold til de nuværende metoder. Første, co-translationel fusion sikrer, at et molekyle af det fluorescerende reporter fremstilles for hvert molekyle af proteinet af interesse, hvilket tillader nøjagtig optælling af proteinproduktion i realtid. For det andet har membranen må…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Plasmidet pCG001 udtrykker UBP1 blev venligst stillet til rådighed af Rohan Baker på John Curtin School of Medical Research. Dette arbejde blev finansieret af March of Dimes Research Grant 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 og NSF KARRIERE prisen 0.746.796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
Riferimenti
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
