Une seule molécule d'imagerie du règlement Gene<em> In vivo</em> Utilisation de l'activation par clivage cotraductionnelle (COTRAC)
Summary
Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC), à l'image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode a été utilisée pour suivre la dynamique d'expression stochastique d'un facteur de transcription, le λ répresseur CI<sup> 1</sup>.
Abstract
Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC) à l'image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode permet de compter le nombre de molécules de protéines produites dans une cellule pendant séquentielles, des fenêtres de temps de cinq minutes. Il nécessite un microscope à fluorescence avec la densité de puissance laser d'excitation d'environ 0,5 à 1 kW / cm 2, ce qui est suffisamment sensible pour détecter des molécules simples protéine fluorescente dans les cellules vivantes. Le rapporteur fluorescent utilisé dans cette méthode se compose de trois parties: une séquence ciblage membranaire, une maturation rapide, protéine fluorescente jaune et une séquence de reconnaissance de protéase. Le rapporteur est fusionnée de manière traductionnelle à l'extrémité N-terminale d'une protéine d'intérêt. Les cellules sont cultivées sur une platine de microscope à température contrôlée. Toutes les cinq minutes, des molécules fluorescentes dans les cellules sont imagés (et plus tard coopérationUnted en analysant les images de fluorescence), puis photobleached de sorte que seules protéines nouvellement traduits sont comptés dans la mesure suivante.
Images de fluorescence résultant de cette méthode peut être analysée par la détection des taches fluorescentes dans chaque image, en les affectant à des cellules individuelles, puis affecter les cellules de lignées cellulaires. Le nombre de protéines produites à l'intérieur d'une fenêtre temporelle dans une cellule donnée est calculé en divisant l'intensité intégrée de taches de fluorescence par l'intensité moyenne des molécules fluorescentes simples. Nous avons utilisé cette méthode pour mesurer les niveaux d'expression de l'ordre de 0-45 molécules simples 5 fenêtres de temps min. Cette méthode nous a permis de mesurer le bruit dans l'expression de l'IC λ répresseur, et a de nombreuses autres applications potentielles en biologie des systèmes.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode COTRAC peuvent être généralisés à mesurer la production d'autres protéines où N-ou C-terminaux conventionnels fusions de protéines fluorescentes peuvent perturber l'activité des protéines. La stratégie COTRAC a trois avantages uniques par rapport aux méthodes actuelles. Tout d'abord, co-traductionnelle de fusion assure une molécule de rapporteur fluorescent est le produit pour chaque molécule de la protéine d'intérêt, ce qui permet un comptage précis de la production de prot…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le plasmide exprimant pCG001 Ubp1 a été aimablement fourni par Rohan Baker à l'École de gestion John Curtin de la recherche médicale. Ce travail a été financé par Mars des dix sous de subvention de recherche de 1 exercice 2011, Mars of Dimes Basil O'Connor Starter Award de bourses de recherche n ° 5-FY20 et d'attribution de la NSF CAREER 0746796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
Riferimenti
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