जीन विनियमन के एकल अणु इमेजिंग<em> Vivo में</em> विखंडन द्वारा Cotranslational सक्रियकरण (CoTrAC) का उपयोग
Summary
हम एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधि, विखंडन द्वारा सक्रियकरण सह translational (CoTrAC), छवि के लिए है प्रोटीन कार्यक्षमता perturbing बिना अणु परिशुद्धता के साथ जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन अणुओं के उत्पादन का वर्णन करता है. इस विधि के लिए एक प्रतिलेखन कारक, λ repressor सीआई के stochastic अभिव्यक्ति गतिशीलता का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है<sup> 1</sup>.
Abstract
हम एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधि, विखंडन द्वारा सक्रियकरण सह translational (CoTrAC) छवि है प्रोटीन कार्यक्षमता perturbing बिना अणु परिशुद्धता के साथ जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन अणुओं के उत्पादन का वर्णन करता है. इस विधि प्रोटीन अनुक्रमिक, पांच मिनट का समय खिड़कियां के दौरान एक कक्ष में उत्पादित अणु की संख्या की गिनती करने के लिए यह संभव बनाता है. यह ~ 0.5 से 1 किलोवाट / 2 सेमी है, जो पर्याप्त रूप से जीवित कोशिकाओं में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन अणु का पता लगाने के लिए संवेदनशील है लेजर उत्तेजना शक्ति घनत्व के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की आवश्यकता है. अनुक्रम लक्ष्यीकरण झिल्ली, एक तेजी से परिपक्व, पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन और एक protease मान्यता अनुक्रम: फ्लोरोसेंट इस विधि में इस्तेमाल संवाददाता तीन हिस्से होते हैं. संवाददाता translationally ब्याज की एक प्रोटीन के एन टर्मिनस से जुड़े हुए है. कोशिकाओं एक खुर्दबीन तापमान नियंत्रित चरण पर हो रहे हैं. हर पांच मिनट के भीतर कोशिकाओं फ्लोरोसेंट अणु (और बाद में सह हैं imagedप्रतिदीप्ति छवियों का विश्लेषण) द्वारा Unted और बाद में photobleached इतना है कि केवल नव अनुवादित प्रोटीन अगले माप में गिने जाते हैं.
प्रतिदीप्ति इस विधि से उत्पन्न छवियों प्रत्येक छवि में फ्लोरोसेंट स्थानों का पता लगाने, उन्हें व्यक्तिगत कोशिकाओं को बताए और फिर सेल प्रजातियों के लिए कोशिकाओं को बताए द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. एक दिया सेल में एक समय खिड़की के भीतर उत्पादित प्रोटीन की संख्या एक फ्लोरोसेंट अणु के औसत तीव्रता से स्पॉट की एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता विभाजित करके गणना की है. हम भी 5 मिनट समय खिड़कियों में 0-45 अणुओं की सीमा में अभिव्यक्ति के स्तर को मापने के लिए इस विधि का इस्तेमाल. इस विधि हमें λ repressor सीआई की अभिव्यक्ति में शोर को मापने के लिए सक्षम होना चाहिए, और सिस्टम जीव विज्ञान में कई अन्य संभावित आवेदन किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoTrAC विधि जहां पारंपरिक या एन सी टर्मिनल फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions प्रोटीन गतिविधि को बाधित कर सकते हैं अन्य प्रोटीन के उत्पादन को मापने के सामान्यीकरण नहीं किया जा सकता है. CoTrAC रणनीति मौजूदा तरीकों पर तीन अ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
प्लाज्मिड Ubp1 pCG001 व्यक्त कृपया मेडिकल रिसर्च के जॉन कर्टिन स्कूल में रोहन बेकर द्वारा प्रदान किया गया था. यह काम मार्च ऑफ डाइम्स अनुसंधान एक FY2011 अनुदान के, ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान अनुसंधान पुरस्कार # 5 – FY20 और NSF कैरियर +०७४६७९६ पुरस्कार के मार्च के द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
Riferimenti
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