Enda molekyl avbildning av genreglering<em> In vivo</em> Använda Cotranslational Aktivering genom klyvning (CoTrAC)
Summary
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi metod, Co-translationell aktivering genom klyvning (CoTrAC), att avbilda produktionen av proteinmolekyler i levande celler med en enda molekyl precision utan att störa proteinets funktionalitet. Denna metod har använts för att följa de stokastiska expressions dynamiken i en transkriptionsfaktor, den λ repressorn CI<sup> 1</sup>.
Abstract
Vi beskriver en fluorescensmikroskopi metod, Co-translationell aktivering genom klyvning (CoTrAC) att avbilda produktionen av proteinmolekyler i levande celler med en enda molekyl precision utan att störa proteinets funktionalitet. Denna metod gör det möjligt att räkna antalet proteinmolekyler som produceras i en cell under sekventiella, fem minuters tidsfönster. Det kräver ett fluorescensmikroskop med laserexcitation effekttäthet ~ 0,5 till 1 kW / cm 2, vilket är tillräckligt känslig för att detektera enstaka fluorescerande proteinmolekyler i levande celler. Den fluorescerande reporter användes i denna metod består av tre delar: ett membran målsekvens, en snabbt mognande, gult fluorescerande protein och ett proteas-igenkänningssekvens. Reportern är translationellt fuserad till N-terminalen av ett protein av intresse. Celler odlas på en temperaturstyrd mikroskop scenen. Var femte minut, är fluorescerande molekyler i celler avbildas (och senare counted genom att analysera fluorescens bilder) och därefter photobleached så att endast nya översatta proteiner räknas i nästa mätning.
Fluorescensbilder följd av denna metod kan analyseras genom att detektera fluorescerande fläckar i varje bild, tilldela dem till enskilda celler och därefter tilldela celler till cellinjer. Antalet proteiner producerade inom ett tidsfönster i en given cell beräknas genom att dividera den integrerade fluorescensintensiteten av fläckar med den genomsnittliga intensiteten av enstaka fluorescerande molekyler. Vi använde denna metod för att mäta uttrycksnivåer i intervallet 0-45 molekyler i enstaka 5 fönster min tid. Denna metod gjorde det möjligt att mäta buller i uttryck av λ repressorn CI, och har många andra potentiella tillämpningar i systembiologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den CoTrAC metoden kan generaliseras för att mäta produktionen av andra proteiner där konventionella N-eller C-terminala fusioner fluorescerande protein kan störa proteinaktivitet. Den CoTrAC Strategin har tre unika fördelar jämfört med dagens metoder. Först säkerställer sam-translationella fusion som en molekyl av den fluorescerande reporter framställs för varje molekyl av proteinet av intresse, vilket möjliggör noggrann räkning av proteinproduktion i realtid. För det andra membran-riktade reportern TSR…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Plasmiden pCG001 uttrycker Ubp1 tillhandahölls vänligen av Rohan Baker på John Curtin School of Medical Research. Detta arbete har finansierats av March of Dimes forskningsbidrag 1-FY2011, March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Research Award # 5-FY20 och NSF KARRIÄR utmärkelse 0.746.796.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Agarose (Low melting temperature) | Lonza | 50100 | |
| Milli-Q H2O | |||
| 5×M9 salts | Following recipe described in 9 | ||
| 20% glucose | |||
| MgSO4 | |||
| CaCl2 | |||
| 50×MEM amino acid solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor |
Bioptechs | FCS-2 | |
| Objective Heater | Bioptechs | Model depends on microscope objective | |
| Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
| Micro cover glasses | VWR | 40CIR-1 | Can be difficult to source; also available from Bioptechs |
| Cover glass/slide gasket | Bioptechs | FCS2 0.75 mm | |
| Fluorescence Microscope | Various | Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software | Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins |
| EM-CCD Camera | Various | Example setup: Andor Ixon DU-898 | Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background |
Riferimenti
- Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
- Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time. Science. 311, 1600-1603 (2006).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).
- Tobias, J. W., Varshavsky, A. Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , A2.2 (2001).
- Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. Single Molecules: a laboratory manual. , 149-169 (2007).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).
- Stagaman, G., Forsyth, J. Bright-field microscopy of semitransparent objects. J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).
- Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. The N-end rule in bacteria. Science. 254, 1374-137 (1991).
