Kvantitativ analyse af Autophagy hjælp Advanced 3D fluorescensmikroskopi
Summary
Autophagy er en allestedsnærværende proces, der gør det muligt for cellerne at nedbryde og genbruge proteiner og organeller. Vi anvender avanceret fluorescens mikroskopi til at visualisere og kvantificere små, men vigtige, fysiske ændringer i forbindelse med induktion af autophagy, herunder dannelse og distribution af autophagosomes og lysosomer, samt deres fusion i autolysosomes.
Abstract
Prostatakræft er den førende form af maligne sygdomme blandt mænd i USA Mens kirurgi indebærer en væsentlig risiko for impotens og inkontinens, har traditionelle kemoterapeutiske tilgange stort set været forgæves. Hormonbehandling er effektiv på et tidligt tidspunkt, men ofte mislykkes med den endelige udvikling af hormon-ildfaste tumorer. Vi har været interesseret i at udvikle lægemidler rettet mod specifikke metaboliske mangel af tumorceller. Vi har for nylig vist, at prostata tumorceller specifikt mangler et enzym (argininosuccinate syntase, eller ASS) involveret i syntesen af aminosyren arginin 1.. Denne betingelse forårsager tumorcellerne at blive afhængig af eksogene arginin, og de gennemgår metabolisk stress, når fri arginin er forårsaget af arginindeiminase (ADI) 1,10. Vi har faktisk vist, at humane prostata cancer celler CWR22 RV1 effektivt dræbt af ADI med caspase-uafhængig apoptose og aggressive autophagy (eller macroautophagy) 1,2,3. Autophagy er en evolutionært-bevarede proces, der tillader celler at metabolisere uønskede proteiner ved lysosomal nedbrydning under ernæringsmæssige sult 4,5. Selvom de væsentlige elementer i denne vej er godt præget 6,7,8,9, mange aspekter af den molekylære mekanisme er stadig uklart – i særdeleshed, er hvilken rolle autophagy i død-respons af prostatakræft celler efter ADI behandling ? For at løse dette spørgsmål, vi krævede en eksperimentel metode til at måle niveauet og omfanget af autophagic respons i celler – og da der er ingen kendte molekylære markører, der kan præcist spore denne proces, valgte vi at udvikle en imaging tilgang, ved hjælp af kvantitativ 3D fluorescensmikroskopi 11,12.
Brug CWR22Rv1 celler specifikt-mærket med fluorescerende prober til autophagosomes og lysosomer, viser vi, at 3D billedstakke erhverves med enten widefield deconvolution mikroskopi (og senere, med super-opløsning, struktureret-belysning mikroskopi) kan tydeligt fange de tidlige stadier af autophagy induktion. Med kommercielt tilgængelige digitale billedanalyse applikationer, kan vi let få statistiske oplysninger om autophagosome og lysosom antal, størrelse, distribution, og graden af colokalisering fra enhver afbildet celle. Denne information giver os mulighed for præcist at spore fremskridt af autophagy i levende celler og giver vores fortsatte undersøgelse af rolle autophagy i cancer kemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens de direkte observation af celler mærket med fluorescerende prober mod LC3 almindeligt accepteret som en standard metode til at bekræfte autophagic respons 6, kvantitativ 3D billeddannelse af det samme system (som vi har gjort) giver hidtil uset information og detaljer om den komplekse proces cellulær autophagy . I særdeleshed, observere vi, at hundredvis (hvis ikke tusindvis) af autophagosomes i levende celler er dannet inden for 80 min af autophagy induktion. Ligeledes ser vi meget interessante morf…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Grant support: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0.120.999 Center for Biophotonics Science & Technology (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Fed), The Research Norges, Leiv Eiriksson rejselegat 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung anerkender også støtte fra Auburn Community Cancer Endowment Fund. RJ Fed anerkender også støtte fra J. McDonald begavelse.
Vi takker Dr. Jenny Wei-Jen Kung og Dr. Bor-wen Wu på DesigneRx for generøs levering af ADI.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
Riferimenti
- Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
- Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
- Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
- Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
- Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
- Crighton, D., Wilkinson, S., O’Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
- Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
- Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
- York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
- Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).
