Autophagy é um processo ubíquo que permite que as células para se degradarem e reciclar proteínas e organelas. Aplicamos microscopia de fluorescência para visualizar avançada e quantificar o pequeno, mas, alterações físicas essenciais associados com a indução de autofagia, incluindo a formação e distribuição de autofagossomas e lisossomas, e sua fusão em autolysosomes.
O câncer de próstata é a forma principal de tumores malignos entre os homens em os EUA Enquanto a cirurgia acarreta um risco significativo de impotência e incontinência, as abordagens quimioterápicos tradicionais têm falhado. A terapia hormonal é eficaz na fase inicial, mas muitas vezes falha com o eventual desenvolvimento de tumores hormônio-refratário. Nós estávamos interessados no desenvolvimento de terapêuticas dirigidas deficiência metabólica específica de células tumorais. Recentemente, mostrou que as células de tumor da próstata não têm especificamente uma enzima (sintase argininosuccinato ou ASS) envolvida na síntese da arginina, um aminoácido. Esta condição faz com que as células do tumor se tornar dependente de arginina exógena, e eles passam por estresse metabólico quando arginina livre está esgotada pela arginina deiminase (ADI) 1,10. Na verdade, temos demonstrado que as células cancerosas humanas da próstata CWR22 RV1 são efetivamente morto por ADI com apoptose caspase-independente e autopha agressivogy (ou macroautophagy) 1,2,3. A autofagia é um processo evolutivamente conservada que permite que as células de metabolizar proteínas indesejadas pelo colapso lisossômico durante inanição nutricional 4,5. Embora os componentes essenciais desta via são bem caracterizados 6,7,8,9, muitos aspectos do mecanismo molecular não são ainda claras – em particular, o que é o papel de autofagia no-resposta a morte de células de cancro da próstata após o tratamento ADI ? A fim de resolver esta questão, necessário um método experimental para medir o nível ea extensão da resposta autofágica em células – e uma vez que não há marcadores moleculares conhecidos que podem controlar com precisão este processo, optamos por desenvolver uma abordagem baseada em imagens, usando 3D microscopia de fluorescência quantitativa 11,12.
Usando CWR22Rv1 células especificamente marcados com sondas fluorescentes para autophagosomes e lisossomos, mostramos que pilhas de imagens 3D adquirido com ou widefield microscopia desconvolução (e mais tarde, com super-resolução, microscopia de iluminação estruturada) pode capturar claramente as fases iniciais de indução autofagia. Com as aplicações de análise de imagem digitais disponíveis comercialmente, podemos facilmente obter informação estatística sobre o número e autophagosome lisossoma, o tamanho, a distribuição, e do grau de co-localização de qualquer célula de imagens. Esta informação permite-nos acompanhar com precisão o progresso da autofagia em células vivas e permite que nossa investigação contínua sobre o papel da autofagia na quimioterapia do cancro.
Enquanto a observação direta de células marcadas com sondas fluorescentes contra LC3 é amplamente aceito como um método padrão para confirmar resposta autofágica 6, imagens 3D quantitativa do mesmo sistema (como temos feito) fornece informações e detalhes sem precedentes sobre o complexo processo de autofagia celular . Em particular, observa-se que centenas (se não milhares) de autophagosomes em células vivas são formadas dentro de 80 min de indução de autofagia. Da mesma forma, observa-se alter…
The authors have nothing to disclose.
Apoio Grant: NIH CA165263, CA150197 NIH, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Centro de Biofotônica da Ciência e Tecnologia (DL Wolfson, FYS Chuang), DOD PC073420 (RJ Negrito), a pesquisa Conselho da Noruega, Leiv Eiriksson viagem Grant 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ Kung também agradece o apoio do Fundo Endowment Cancer Comunidade Auburn. RJ Negrito também reconhece o apoio da J. McDonald investidura.
Agradecemos ao Dr. Jenny Wei-Jen Kung e Dr. Bor-wen Wu em DesigneRx para generosa oferta de ADI.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
HEPES | Sigma | H4034 | |
Casein | Sigma | C5890 | |
Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
Saponin | Sigma | S4521 | |
Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |