Мы описываем супер-разрешение изображения методом для исследования структурной организации бактериальных FtsZ-кольцо, существенную устройство для деления клеток. Этот метод основан на количественном анализе фотоактивированного локализации микроскопии (PALM) изображений и может быть применен в других бактериальных белков цитоскелета.
Бактериальные деления клеток требует скоординированных сборки из более чем десяти основных белков в midcell 1,2. Центральное место в этом процессе является формирование кольцевых супраструктуры (Z-кольцо) белком FtsZ в плане разделения 3,4. Z-кольцо состоит из нескольких одноцепочечной протофиламентов FtsZ, и понимание расположения протофиламентов внутри Z-кольцо обеспечит понимание механизма Z-кольцо в сборе и его функции как сила, генератор 5,6. Эта информация осталась неуловимой из-за существующих ограничений в обычной флуоресцентной микроскопии и электронной микроскопии. Обычные флуоресцентной микроскопии не в состоянии обеспечить высокое разрешение изображения Z-кольцо из-за дифракционного предела света (~ 200 нм). Электрон cryotomographic изображений обнаружено разбросаны FtsZ протофиламентов в небольших C. crescentus клеток 7, но трудно применять на больших клетках, таких какE.coli или B. Сенная. Здесь мы описываем применение супер-разрешение флуоресцентного метода микроскопии, фотоактивированного микроскопии локализации (PALM), количественно характеризующие структурную организацию E. палочки Z-кольцо 8.
PALM изображений предлагает как высоким пространственным разрешением (~ 35 нм) и конкретные маркировки чтобы однозначной идентификации белков-мишеней. Мы назвали FtsZ с фотоактивируемых флуоресцентного белка mEos2, который переключается с зеленой флуоресценции (возбуждение = 488 нм) до красной флуоресценции (возбуждение = 561 нм) при активации при 405 нм 9. Во время эксперимента PALM, одна FtsZ-mEos2 молекул стохастически активируется и соответствующая тяжести положения отдельных молекул определяется с <20 нм точность. Супер-разрешение изображения Z-кольцо, затем реконструирован путем наложения тяжести позиций всех обнаруженных FtsZ-mEos2 молекул.
<р = класса "jove_content"> Используя этот метод, мы обнаружили, что Z-кольцо имеет фиксированную ширину ~ 100 нм и состоит из свободных расслоение протофиламентов FtsZ, которые перекрывают друг с другом в трех измерениях. Эти данные служат трамплином для дальнейших исследований клеточного цикла зависимости изменения Z-кольцо 10 и может быть применен к другим белкам интерес.PALM изображения содержат информацию о молекуле счета и позиции внутри клетки, что позволяет детальный анализ распределения и расположения молекул белка-мишени, которую трудно достичь другими средствами. Ниже мы приводим меры предосторожности, которые должны быть приняты для извлечен?…
The authors have nothing to disclose.
Грант: 5RO1GM086447-02.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
50 x MEM Amino Acids | Sigma | M5550 | |
100 x MEM Vitamins | Sigma | M6895 | |
IPTG | Mediatech | 46-102-RF | |
16% Paraformaldehyde | Electron Micrsocopy Sciences | 15710-S | |
SeaPlaque GTG Agarose | Lonzo | 50111 | |
50 nm Gold Beads | Microspheres-Nanospheres | 790113-010 | |
FCS2 Imaging Chamber | Bioptechs | ||
Stage Adaptor | ASI | I-3017 | |
Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
1.45 NA, 60x Objective | Olympus | ||
IXON EMCCD Camera | Andor Technology | DU897E | |
488-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
561-nm Sapphire Laser | Coherent | ||
405-nm CUBE Laser | Coherent |