Toute Mont ARN fluorescent<em> In situ</emHybridation> d'<em> Drosophila</em> Embryons
Summary
Nous décrivons ici un ensemble de montage fluorescent<em> In situ</em> Hybridation (FISH) pour la détermination des propriétés d'expression et la localisation des ARN exprimés au cours de l'embryogenèse chez la drosophile,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Évaluer le profil d'expression d'un gène, ainsi que les propriétés de localisation subcellulaire de ses ARN transcrit, sont des éléments clés pour la compréhension de sa fonction biologique au cours du développement. ARN hybridation di situ (ISH-ARN) est une méthode puissante utilisée pour visualiser les propriétés de distribution d'ARN, que ce soit au niveau de tous les organismes, cellulaires ou subcellulaires 1. ARN-ISH est basée sur l'hybridation d'une sonde d'acide nucléique marquée (par exemple un ARN antisens, oligonucléotides) complémentaire de la séquence d'un ARNm ou d'une cible non-codante d'ARN d'intérêt 2. Comme la procédure exige des renseignements séquence primaire seul à générer une séquence des sondes spécifiques, il peut être universellement appliquée à un large éventail d'organismes et les échantillons de tissus 3. En effet, un certain nombre d'études à grande échelle ISH ont été prises pour documenter l'expression des gènes et de l'ARN dynamique de localisation dans divers organismes modèles, ce qui a conduit à lamise en place de ressources communautaires importantes 4-11. Bien qu'une variété de marquage des sondes et des stratégies de détection ont été développées au fil des ans, l'utilisation combinée des réactifs de détection à marquage fluorescent et enzymatiques étapes d'amplification du signal offrent des améliorations significatives dans la sensibilité et la résolution de la procédure 12. Ici, nous décrivons une fluorescence optimisé méthode d'hybridation in situ (FISH) utilisant l'amplification du signal tyramide (TSA) pour visualiser l'expression de l'ARN et la dynamique de localisation des embryons de drosophile mis en scène. La procédure est réalisée en format 96 puits Plaque PCR, ce qui facilite grandement le traitement simultané d'un grand nombre d'échantillons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour les étapes de synthèse de la sonde, nous générons habituellement en run-off des sondes d'ARN antisens par transcription in vitro à partir des ADNc pleine longueur drosophile amplifiés à partir des plasmides présents dans la collection de Drosophila Gene (DGC), une ressource en détail à l'adresse suivante: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Cette approche a été large…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux menés dans le laboratoire Lécuyer est soutenu par un financement de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) et le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre et Gaël Moquin-Beaudry sont pris en charge par les bourses de recherche de premier cycle du CRSNG, tandis que Carole Iampietro est pris en charge par la bourse postdoctorale Angelo Pizzagalli.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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