כאן אנו מתארים שלם הר ניאון<em> באתר</em> הכלאת פרוטוקול (דגים) לקביעת מאפייני הביטוי ולוקליזציה של RNAs הביעו במהלך ההתפתחות עוברת בזבוב הפרות,<em> דרוזופילה melanogaster</em>.
הערכת דפוסי הביטוי של גן, כמו גם את תכונות לוקליזציה subcellular של רנ"א התעתיקים שלה, הן תכונות מרכזיות להבנת התפקוד הביולוגי שלה במהלך פיתוח. רנ"א כלאה באתר (RNA-ish) הוא שיטה חזקה המשמשת להמחשת מאפייני הפצת RNA, יהיה זה ברמת האורגניזם, סלולרית או subcellular 1. RNA-ish מבוסס על הכלאה של חללית שכותרתו חומצות גרעין (למשל antisense RNA, oligonucleotides) משלימה הרצף של mRNA או יעד שאינו קידוד-RNA של עניין 2. כנוהל מחייב מידע רצף ראשוני בלבד כדי ליצור רצף בדיקות ספציפיות, זה יכול להיות מיושם באופן אוניברסלי למגוון רחב של יצורים ודגימות רקמה 3. ואכן, מספר מחקרי איש בקנה מידה גדול יושם לתעד ביטוי גנים ודינמיקת RNA לוקליזציה באורגניזם מודל שונה, מה שהוביל להקמת משאבי קהילה חשובים 4-11. בעוד מגוון של תיוג בדיקה וזיהוי אסטרטגיות פותח לאורך השנים, השימוש בשילוב של חומרים כימיים זיהוי כותרת-fluorescently וצעדי הגברת אותות אנזימטית מציע שיפורים משמעותיים ברגישות וברזולוציה של ההליך 12. כאן, אנו מתארים ניאון מותאם בשיטת כלאה באתר (FISH) העסקת הגברת אות tyramide (TSA) לדמיין ביטוי RNA ודינמיקת לוקליזציה בעוברי תסיסנית מבוימת. ההליך מתבצע ב96-PCR צלחת פורמט היטב, שמאוד מקל על העיבוד בו הזמני של מספר גדול של דגימות.
לצעדי סינתזת בדיקה, אנחנו בדרך כלל לייצר חלליות ניגרו antisense RNA שעתוק במבחנה על ידי מcDNAs תסיסנית באורך מלא מוגבר מפלסמידים נמצאו בדרוזופילה ג'ין האוסף (DGC), משאב המפורט באתר הבא: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. גיש?…
The authors have nothing to disclose.
העבודה שנערכה במעבדת Lécuyer נתמכת על ידי מימון מהלאומיים למדעים והנדסת המועצה של קנדה (NSERC), מכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וFonds דה המשוכללת והנדירה en סנטה קוויבק (FRSQ). פאביו אלקסיס לפבר וגאל Moquin-ודרי נתמכת על ידי מחקר לתואר הראשון studentships NSERC, בעוד קרול Iampietro נתמך על ידי מלגת דוקטורט אנג'לו Pizzagalli.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
3M sodium acetate | |||
Cold 100% ethanol. | |||
Cold 70% ethanol. | |||
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
Heptane | |||
Methanol | |||
proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |