전체 마운트 RNA 형광<em> 현장에서</em의> 하이브리드<em> Drosophila</em> 태아
Summary
여기 우리는 전체 마운트 형광을 설명<em> 현장에서</em과일 플라이의 embryogenesis 동안 표현 RNAs의 표현 및 현지화 특성을 결정하기위한> 하이브리드 (물고기) 프로토콜,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
유전자뿐만 아니라 베꼈 RNA의 subcellular 지방화 속성의 표현 패턴을 평가하는 것은 개발 과정의 생물학적 기능을 이해하기위한 핵심 기능입니다. 현장 하이브리드 화의 RNA (RNA 살쯤)는 RNA 배포 속성을 시각화하는 데 사용되는 강력한 방법입니다, organismal, 휴대 또는 subcellular 레벨 1에서합니다. RNA 살쯤는 mRNA 또는 관심 (2)의 비 코딩 RNA 대상의 순서를 보완이라는 핵산 산 프로브 (예 : 안티센스 RNA, oligonucleotides)의 하이브리드에 기반을두고 있습니다. 프로 시저가 순서 특정 프로브를 생성 할 만 기본 순서 정보를 필요에 따라, 그것은 보편적 생물과 조직 표본 3의 광범위한 적용 할 수 있습니다. 사실, 대규모 틱 연구 번호가 유전자 발현을 문서화하고 다양한 모델 생물에서 현지화 역학을 RNA하기 위해 구현되었으며, 이는하게되었다중요 지역 사회 자원 4-11의 설립. 프로브 라벨 및 검색 전략의 다양한이 년 동안 개발 된 반면, 휘황-라벨 감지 시약 및 효소 신호 증폭 단계의 결합 사용은 절차 12 감도와 해상도에 상당한 향상을 제공합니다. 여기, 우리는 무대 Drosophila의 배아에서 RNA의 발현 및 현지화 역학을 시각화하는 tyramide 신호 증폭 (TSA)을 채용 원위치 하이브리드 화 방법 (물고기)에 최적화 된 형광을 설명합니다. 절차는 크게 샘플을 다수의 동시 처리를 용이하게 96도 PCR 플레이트 형식으로 수행됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로브 합성 단계의 경우, 우리는 일반적으로 Drosophila 유전자 컬렉션 (DGC), 다음 웹 사이트에서 설명하는 자원에서 발견 plasmids의 증폭 전체 길이 Drosophila의 cDNAs에서 체외 스크립트에 의해 실행 – 오프 안티센스 RNA 프로브를 생성 : http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 페이지 14,15. 이 접근 방식은 플라이 배아 9,16의</su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lécuyer 실험실에서 실시 작품은 국립 과학 캐나다의 공학 협의회 (NSERC), 건강 연구 (CIHR)와 Fonds 드 공들인 실내 Santé 뒤 퀘벡 (FRSQ)의 캐나다 연구소에서 자금을 지원합니다. 캐롤 Iampietro는 안젤로 Pizzagalli 박사 교제를 지원하는 동안 파비오 알렉시스 Lefebvre와 게일 Moquin – Beaudry은 NSERC 학부 연구 studentships에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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