Hele Mount RNA Fluorescent<em> In situ</em> Hybridisering av<em> Drosophila</em> Embryoer
Summary
Her beskriver vi en hel-mount fluorescerende<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) protokoll for å bestemme uttrykket og lokalisering egenskaper RNAS uttrykk under embryogenese i bananflue,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Assessing uttrykket mønster av et gen, samt subcellulære lokalisering egenskaper av sine transkriberte RNA, er sentrale funksjoner for å forstå den biologiske funksjon under utvikling. RNA in situ hybridisering (RNA-ISH) er en kraftig metode som brukes for å visualisere RNA distribusjon egenskaper, det være seg på organismebiologi, mobil eller subcellulære nivå 1. RNA-ISH er basert på hybridisering av en merket nukleinsyresonde (f.eks antisens RNA, oligonukleotider) komplementær til sekvensen av en mRNA eller en ikke-kodende RNA mål av interesse 2. Som prosedyren krever primære sekvensen informasjon alene å generere sekvensspesifikke prober, kan den være universelt anvendt til et bredt spekter av organismer og vevsprøver 3. Faktisk har en rekke store ISH studier er gjennomført for å dokumentere genuttrykk og RNA lokalisering dynamikk i ulike modellorganismer, som har ført tiletablering av viktige samfunnets ressurser 4-11. Mens en rekke probe merking og gjenkjenning strategier har blitt utviklet gjennom årene, kombinert bruk av fluorescently-merket deteksjon reagenser og enzymatiske signalamplifikasjon trinn gi betydelige forbedringer i følsomhet og oppløsning av prosedyren 12. Her beskriver vi en optimalisert fluorescerende in situ hybridisering metode (FISH) ansette tyramide signal forsterkning (TSA) for å visualisere RNA uttrykk og lokalisering dynamikk i iscenesatt Drosophila embryo. Prosedyren utføres i 96-brønns PCR-plate-format, som i stor grad letter den samtidige behandling av et stort antall prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
For probe syntese trinn, vi vanligvis genererer avrenning antisens RNA prober ved in vitro transkripsjon fra full-lengde Drosophila cDNA'ene forsterket fra plasmider finnes i Drosophila Gene Collection (DGC), en ressurs detaljert på følgende nettside: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Denne tilnærmingen har vært brukt mye i stor skala ISH studier med sikte på kartlegging genuttrykk og mRNA…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbeid utført i LÉCUYER laboratoriet er støttet av midler fra National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), den kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) og Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre og Gaël Moquin-Beaudry støttes av NSERC lavere forskning studentships, mens Carole Iampietro støttes av Angelo Pizzagalli postdoktorstipend.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
Riferimenti
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O’Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetica. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
