Всего горы РНК Флуоресцентные<em> На месте</em> Гибридизация<em> Drosophila</em> Эмбрионы
Summary
Здесь мы опишем весь монтаж флуоресцентных<em> На месте</em> Гибридизации (FISH) протокол для определения экспрессии и локализации свойств РНК, высказанные в ходе эмбриогенеза дрозофилы,<em> Дрозофилы</em>.
Abstract
Оценка экспрессии генов, а также субклеточном свойства локализации его транскрипции РНК, являются ключевыми для понимания особенностей его биологической функции в процессе разработки. РНК в гибридизация (РНК-ISH) представляет собой мощный метод, используемый для визуализации свойств РНК распределения, будь то на организменном, клеточном и субклеточном уровнях 1. РНК-ISH основан на гибридизации меченого зонда нуклеиновой кислоты (например, антисмысловую РНК, олигонуклеотиды), комплементарный последовательности мРНК и некодирующих РНК объектом интереса 2. Так как процедура требует первичной информации о последовательности только для генерации последовательности конкретных датчиков, он может применяться универсально для широкого круга организмов и образцов тканей 3. Действительно, ряд крупномасштабных ISH исследования были реализованы к документу экспрессии генов и РНК локализации динамики в различных модельных организмов, которые привели ксоздание важных ресурсов сообщества 4-11. В то время как различные маркировки и обнаружения зонда стратегии были разработаны на протяжении многих лет, в сочетании использование флуоресцентно-меченных обнаружения реагентов и ферментативных реакций усиления сигнала предлагают значительные улучшения чувствительности и разрешающей процедуры 12. Здесь мы описываем оптимизированы флуоресцентные на месте методом гибридизации (FISH) с использованием tyramide усиления сигнала (TSA) для визуализации экспрессии РНК и локализации динамику в постановке эмбрионов дрозофилы. Процедура проводится в 96-луночный ПЦР планшет формата, что значительно облегчает одновременную обработку большого количества образцов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для шагов зонд синтеза, мы обычно генерируют стоки антисмысловых РНК-зондов в пробирке транскрипции от полной длины кДНК Drosophila амплифицировали из плазмиды найден у дрозофилы ген Collection (РСК), ресурс подробно описаны на сайте: http://www .fruitfly….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работы, проводимые в лаборатории Лекьюайер поддерживается финансирование от Национального наук и инженерного совета Канады (NSERC), Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR) и Фон-де-Recherche ан Здоровье Квебека (FRSQ). Фабио Алексис Лефевра и Гаэль Moquin-Бодри поддерживается NSERC студентов studentships исследования, в то время как Кэрол Iampietro поддерживается Angelo Pizzagalli докторской стипендии.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
Riferimenti
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O’Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetica. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
