Todo el monte ARN fluorescente<em> In situ</em> La hibridación de<em> Drosophila</em> Los embriones
Summary
Aquí se describe un fluorescente de todo el montaje<em> In situ</em> Hibridación (FISH) protocolo para determinar las propiedades de expresión y localización de ARN expresados durante la embriogénesis en la mosca de la fruta,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Evaluar el patrón de expresión de un gen, así como las propiedades de localización subcelular de sus ARN transcrito, son características clave para la comprensión de su función biológica durante el desarrollo. ARN hibridación di situ (ISH-RNA) es un poderoso método utilizado para la visualización de las propiedades de ARN de distribución, ya sea a nivel organismal, celular o subcelular 1. ARN-ISH se basa en la hibridación de una sonda de ácido nucleico marcada (por ejemplo, ARN antisentido, oligonucleótidos) complementaria a la secuencia de un ARNm o un objetivo no codificante de ARN de interés 2. A medida que el procedimiento requiere información de la secuencia primaria por sí sola para generar sondas específicas de secuencia, que puede aplicarse universalmente a una amplia gama de organismos y muestras de tejido 3. De hecho, un número de estudios a gran escala ISH se han implementado para documentar la expresión génica y ARN dinámica de localización en diversos organismos modelo, que ha llevado a laestablecimiento de recursos comunitarios importantes 4-11. Mientras que una variedad de la sonda de etiquetado y estrategias de detección se han desarrollado a lo largo de los años, el uso combinado de los reactivos de detección marcadas con fluorescencia y enzimáticas pasos de amplificación de señal ofrecen mejoras significativas en la sensibilidad y la resolución del procedimiento 12. A continuación, describimos un fluorescente optimizado método de hibridación in situ (FISH) utilizando amplificación de la señal tiramida (TSA) para visualizar la expresión del ARN y la dinámica de localización en una puesta de embriones de Drosophila. El procedimiento se lleva a cabo en 96-y formato de placa de PCR, lo que facilita en gran medida el procesamiento simultáneo de grandes números de muestras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para ver los pasos de síntesis de la sonda, que suelen generar escorrentía antisentido sondas de ARN por transcripción in vitro de larga duración cDNAs amplificados a partir de plásmidos de Drosophila se encuentran en la Colección de Drosophila Gene (DGC), un recurso detalla en la siguiente dirección: http:// .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Este enfoque ha sido utilizado ampliamente en estud…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo realizado en el laboratorio Lécuyer con el apoyo de fondos de la Nacional de Ciencias e Ingeniería de Canadá (NSERC), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) y el Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre y Gaël Moquin-Beaudry son apoyados por NSERC becas de investigación de pregrado, mientras que Carole Iampietro con el apoyo de la beca postdoctoral Pizzagalli Angelo.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
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