Hel Mount RNA Lysrör<em> In situ</em> Hybridisering av<em> Drosophila</em> Embryon
Summary
Här beskriver vi en hel-mount lysrör<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) protokoll för att bestämma uttrycket och lokalisering egenskaper RNA uttrycks under embryogenes i bananfluga,<em> Drosophila melanogaster</em>.
Abstract
Bedöma uttrycksmönstret av en gen, liksom subcellulära egenskaper lokalisering av dess transkriberade RNA är viktiga egenskaper för att förstå dess biologiska funktion under utveckling. RNA in situ hybridisering (RNA-ish) är en kraftfull metod som används för att visualisera RNA fördelning egenskaper, oavsett om det vid organismbiologi, cellulära eller subcellulära nivå 1. RNA-ISH är baserad på hybridiseringen av en märkt nukleinsyrasond (t ex antisens-RNA, oligonukleotider) komplementär till sekvensen av ett mRNA eller ett icke-kodande RNA-mål av intresse 2. Eftersom förfarandet kräver primära sekvensinformation enbart för att generera sekvensspecifika prober, kan den allmänt tillämpas på en brett spektrum av organismer och vävnadsprov 3. I själva verket har ett antal storskaliga ISH studier genomförts för att dokumentera genuttryck och RNA lokalisering dynamiken i olika modellorganismer, vilket har lett tilletablering av viktiga samhällets resurser 4-11. Medan en mängd sond märkning och strategier upptäckt har utvecklats under åren, den kombinerade användningen av fluorescensmärkta detektionsreagens och enzymatiska signal steg förstärkning erbjuder betydande förbättringar i känslighet och upplösning av förfarandet 12. Här beskriver vi en optimerad fluorescent in situ hybridisering metod (FISH) använder tyramid signalförstärkning (TSA) för att visualisera RNA-uttryck och dynamik lokalisering i iscensatta Drosophila embryon. Förfarandet utförs i 96-brunnars PCR-platta format, vilket avsevärt underlättar samtidig bearbetning av ett stort antal prover.
Protocol
Representative Results
Discussion
För steg probe syntes skapar vi vanligtvis run-off antisens RNA-sonder genom in vitro transkription från hellånga Drosophila cDNA förstärkta från plasmider finns i Drosophila gensamlingen (DGC), en resurs som beskrivs på följande webbplats: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning i stora studier skala ISH syftar till att kartlägga genu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet utförs i LÉCUYER laboratoriet stöds av medel från National Sciences och teknik Council of Canada (NSERC), den kanadensiska Institutes of Health Research (CIHR) och Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre och Gaël Moquin-Beaudry stöds av NSERC grundutbildningen forskning doktorandtjänster, medan Carole Iampietro stöds av Angelo Pizzagalli postdoktorsstipendium.
Materials
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
Riferimenti
- Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O’Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetica. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
