Procedure voor decellularisatie van Varkens Heart van Retrograde coronaire perfusie
Summary
Een methode om snel en volledig cellulaire componenten uit een intact varkens hart door retrograde perfusie beschreven. Deze methode levert een plaatsspecifieke cardiale extracellulaire matrix scaffold die het potentieel voor gebruik in verscheidene klinische toepassingen.
Abstract
Perfusion-based geheel orgaan ontcelling heeft onlangs verworven belang op het gebied van weefselmanipulatie als middel om site-specifieke extracellulaire matrix scaffolds maken, terwijl grotendeels behoud van de natieve structuur van de steiger. Tot op heden is deze benadering gebruikt in verschillende orgaansystemen, waaronder het hart, longen en lever 1-5. Previous decellularisatie werkwijzen voor weefsels geen gemakkelijk toegankelijke vasculaire netwerk zijn uitgegaan van langdurige blootstelling van weefsel oplossingen van wasmiddelen, zuren of enzymatische behandeling als een middel om de cellulaire en nucleaire componenten uit het omringende extracellulaire omgeving 6-8. De effectiviteit van deze methoden scharnierend op het vermogen van de oplossingen het weefsel permeaat via diffusie. In tegenstelling, perfusie van organen door het natuurlijke vasculaire systeem effectief verminderd de verspreiding afstand en vergemakkelijkt het transport van decellularizatide agenten in het weefsel en cellulaire componenten uit het weefsel. Hierin beschrijven we een methode om een intacte varkens hart volledig decellularize door coronaire retrograde perfusie. Het protocol leverde een volledig cardiale cellen ontdane extracellulaire matrix (ECM-c) scaffold met de driedimensionale structuur van het hart intact. Onze methode een aantal enzymen, wasmiddelen, en zuren combinatie met hypertone en hypotone spoelingen te helpen bij de lysis van cellen en verwijdering. Het protocol een trypsine-oplossing om cellen van de matrix gevolgd door Triton X-100 en natriumdeoxycholaat oplossingen helpen bij verwijdering van celmateriaal los. De beschreven protocol gebruikt ook perfusie snelheden van meer dan 2 L / min gedurende langere tijd. De hoge stroomsnelheid, gekoppeld met een oplossing wijzigingen mogelijk transport van middelen om het weefsel zonder verontreiniging van celresten en gewaarborgd effectieve spoelen van het weefsel. De beschreven methode verwijderd alle nucleaire materiaal van native varkens hartweefsel, waardoor een site-specifieke cardiale ECM steiger die kunnen worden gebruikt voor verschillende toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De huidige studie beschreven methodologie voor consistente en efficiënte decellularisatie van een varkens hart. Het protocol was een modificatie van een eerder gepubliceerde report 1 en opgenomen langere blootstelling aan verhoogde druk en debiet die meer herhaalbare resultaten ontvangen. De resulterende ontcelde weefsel voldeed aan alle gepubliceerde criteria voor een succesvolle decellularisatie van weefsel 2. Frequente veranderingen oplossing werden uitgevoerd om de herinvoering van celmateriaa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Brogan Gast, Michelle Weaver, en Kristen Lippert erkennen. De financiering voor dit onderzoek werd verstrekt door NIH Grant R03EB009237, evenals NIH-beurzen voor opleiding T32EB001026-06 van het National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering en T32HL076124-05.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Trypsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Fisher | BP399-20 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-500G | |
| Peracetic Acid | Pfaltz and Bauer | P05020 | 35% CAS# 79-21-0 |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pump Drive | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | 96400-18 | Size 18 |
| Barbed Reducer | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
Riferimenti
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. , (2008).
- Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
- Uygun, B. E., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , (2010).
- Wainwright, J. M., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 525-532 (2010).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32, 3233-3243 (2011).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. , (2012).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).
- Akhyari, P., et al. The quest for an optimized protocol for whole-heart decellularization: a comparison of three popular and a novel decellularization technique and their diverse effects on crucial extracellular matrix qualities. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 915-926 (2011).
- Weymann, A., et al. Development and evaluation of a perfusion decellularization porcine heart model–generation of 3-dimensional myocardial neoscaffolds. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 75, 852-860 (2011).
- Cortiella, J., et al. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (1089).
- Remlinger, N. T. Hydrated xenogeneic decellularized tracheal matrix as a scaffold for tracheal reconstruction. Biomaterials. 31, 3520-3526 (2010).
- Sellaro, T. L., Ravindra, A. K., Stolz, D. B., Badylak, S. F. Maintenance of hepatic sinusoidal endothelial cell phenotype in vitro using organ-specific extracellular matrix scaffolds. Tissue Eng. 13, 2301-2310 (2007).
- Wainwright, J. M. Right ventricular outflow tract repair with a cardiac biologic scaffold. Cells, tissues, organs. 195, 159-170 (2012).
