שינוי ורקומבינציה גנטי של תרבויות איברי בלוטות רוק

Summary

טכניקה גנטית כדי לתמרן בתוך כל תאי האפיתל<em> Vivo לשעבר</em> בלוטות תרבית עוברית של עכברי לסת תחתונה (SMGs) באמצעות העברת גנים נגיפית מתוארות. שיטה זו מנצלת את היכולת המולדת של SMG האפיתל וmesenchyme ספונטני לrecombine לאחר פרידה וזיהום של יסודות אפיתל עם וקטורי adenoviral.

Abstract

מסעף המורפוגנזה מתרחש במהלך ההתפתחות של איברים רבים, ובלוטת הלסת התחתונה העכבר העוברית (SMG) היא מודל קלסי ללימוד הסתעפות המורפוגנזה. בSMG פיתוח, תהליך זה כרוך איטרטיבי צעדים של ניצן אפיתל והיווצרות דביקה, סופו של דבר לתת לעלייה לרשת מסועפת של acini מורכבת וצינורות, המשמשת לייצור ולשנות / להעביר את הרוק, בהתאמה, לחלל הפה ^{1 – 3.} קרום אפיתל הקשורים למרתף וההיבטים של תא mesenchymal, כוללים תאי mesenchyme, גורמי גדילה והתאי, המיוצרים על ידי תאים אלה, הם קריטיים למנגנון ההסתעפות, למרות כמה האירועים התאיים ומולקולריים מתואמים נשאר הבינו היטב ⁴ . המחקר של המנגנונים המולקולריים נהיגת התקדמות המורפוגנזה אפיתל הבנת מנגנוני התפתחות שלנו ומספק תובנה regener האפשריגישות רפואה ative. מחקרים כאלה כבר הקשו בשל העדר השיטות יעילות למניפולציה גנטית של האפיתל הרוק. נכון לעכשיו, תמרת adenoviral מייצגת את השיטה היעילה ביותר להכוונת תאי אפיתל בבלוטות למבוגרות in vivo ^5. עם זאת, בexplants העוברי, mesenchyme צפוף וקרום המרתף המקיף את תאי האפיתל מונעים גישה נגיפית לתאי האפיתל. אם mesenchyme מוסר, האפיתל ניתן transfected באמצעות adenoviruses, ויסודות אפיתל יכולים לחדש את הסתעפות המורפוגנזה בנוכחות Matrigel או laminin-111 ^6,7. צמיחת הגמד אפיתל mesenchyme ללא דורשת גם תוספת נוספת עם גורמי גדילה מסיסים ולא לסכם המורפוגנזה הסתעפות באופן מלא כפי שהוא מתרחש בבלוטות שלמות ^8. כאן אנו מתארים טכניקה המאפשרת תמרת adenoviral של תאי האפיתל והתרבות של דואר transfectedpithelium עם mesenchyme המשויך. בעקבות microdissection של SMGs העוברי, הסרת mesenchyme והזיהומים נגיפיים של האפיתל עם אדנווירוס GFP המכיל, אנו מראים כי האפיתל משלב מחדש באופן ספונטני עם mesenchyme הנגוע, משחזר מבנה בלוטות SMG שלם ומסועף המורפוגנזה. אוכלוסיית תאי אפיתל המהונדס גנטי ניתן לפקח בקלות באמצעות שיטות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגילות, אם תייג-fluorescently מבני adenoviral משמשים. שיטת רקומבינציה הרקמות המתוארות כאן היא כיום השיטה היעילה והנגישה ביותר לtransfection של תאי האפיתל עם וקטור פראי סוג או מוטציה בתוך מבנה רקמת 3D מורכב שאינו דורש דור של בעלי חיים מהונדסים.

Protocol

הפרוטוקול מכיל ארבעה שלבים עיקריים, כמתואר באיור 1. כל הצעדים מתוארים בפירוט מלא. בניית adenovirus וטיהור נגיפית צריכות להיות מופעלים מראש של קצירת האיברים לשימוש בהתמרה הגנטית של יסודות אפיתל גזור. כל אמצעי בטיחות BSL-2 הסטנדרטי צריך להיות אחרי כשעובד עם adenoviruses. </p…

Representative Results

הזרימה של צעדי הניסוי המרכזיים מתוארת באיור 1. דוגמה של SMG שלם, גמד אפיתל מבודד, וmesenchyme המקביל שלה מוצגת באיור 2. תמונות של brightfield SMGs מורכב, שממשיך לעבור הסתעפות המורפוגנזה כאשר vivo לשעבר תרבותי לזמנים שצוינו, המוצגים באיור 3. בלוטות recombined …

Discussion

טכניקת רקומבינציה אפיתל-mesenchymal vivo לשעבר פורסמה לראשונה לבלוטות רוק לסת תחתונות בשנת 1981 ^16. בפרוטוקול זה, אנו עומדים בהרחבה על השיטה המקורית, באמצעות זיהום adenoviral כדי לתפעל ביטוי גני התא אפיתל בהקשר של בלוטה התחברה מחדש. אנו מראים כי אחוז של תאי האפיתל נגוע בא?…

Materials

Name of the Reagent	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/Ham’s F12 Medium without phenol red	Life Technologies	21041-025
Penicillin and Streptomycin	Life Technologies	15070-163	10X stock
Dispase	Life Technologies	17105-041	Freeze single use aliquots at -20C
BSA	Sigma	A2934-100G	Fraction V, low endotoxin
Adeno-X-GFP	BD Biosciences	8138-1	Should be high titer (1×1010 pfu/ml). CsCl purified viruses are more effective than column-purified viruses in this assay.
16% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710	Diluted to 2% in PBS with 5% sucrose (w/v)
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Life Technologies	70011-044	Prepared from 10X stock
Hank’s Balanced Salt Solution	Life Technologies	14175095	no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red
Transferrin	Sigma	T8158	25 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media. Freeze single-use aliquots at -20C
L- Ascorbic acid (Vitamin C)	Sigma	A4403	75 mg/ml stock solution in DMEM/F12 media.Freeze single-use aliquots at -20C
			Table 1. List of reagents required for SMG recombination protocol.
10 cm sterile plastic dishes	Corning	430167	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
Stereo dissecting microscope with transmitted light base	Nikon	SMZ645	Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base.
35 mm tissue culture dishes	Falcon	353001	Non-tissue culture-treated plates can also be used.
50 mm diameter microwell dishes	MatTek Corporation	P50-G-1.5-14F
Nuclepore Track-Etch membrane filters	Whatman	110405	13 mm diameter, 0.1 mm pore size
Widefield fluorescence microscope	Carl Zeiss, USA	Axio Observer Z1	Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	TCS SP5	Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used.
Timed-pregnant female mice, strain CD-1 or ICR	Charles River Labs		Embryos are harvested on day 13 (with day of plug discovery designated as day 0).
Scalpel blade #11	Fine Science Tools	10011-00
Scalpel handle #3	Fine Science Tools	10003-12
Dumont #5 forceps inox alloy, 0.05mm X 0.02mm	Fine Science Tools	11252-20	Ideal for harvesting glands from embryos
Dumont #5 forceps dumostar alloy, 0.05mm X 0.01mm	Fine Science Tools	11295-20	Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used.
			Table 2. Equipment used in SMG recombination protocol.