Een<em> In vivo</em> Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test
Summary
Wij presenteren een<em> In vivo</em> Assay om bloedvat permeabiliteit testen. Deze assay is gebaseerd op intraveneuze injectie van een kleurstof en daaropvolgende visualisatie van de diffusie in interstitiële ruimtes.
Abstract
Deze methode is gebaseerd op de intraveneuze injectie van Evans Blue in muizen als proefdier model. Evans blauw is een kleurstof die bindt albumine. Onder fysiologische omstandigheden het endotheel is ondoordringbaar voor albumine, zodat Evans blauw gebonden aan albumine blijft beperkt binnen de bloedvaten. Onder pathologische omstandigheden die verhoogde vasculaire permeabiliteit endotheelcellen via gedeeltelijk verliezen hun nauwe contacten en het endotheel permeabel voor kleine eiwitten zoals albumine. Deze voorwaarde maakt extravasatie van Evans Blue in weefsels. Een gezonde endotheel voorkomt uitstorting van de kleurstof in de naburige gevasculariseerde weefsels. Organen met een verhoogde permeabiliteit zal aanzienlijk toegenomen blauwe kleur ten opzichte van organen met intacte endotheel. Het niveau van vasculaire permeabiliteit kan worden vastgesteld door eenvoudige visualisatie of kwantitatieve meting van de kleurstof opgenomen per milligram weefsel van proefdieren versus controle / weefsel. Twee powerful aspecten van deze assay zijn eenvoud en kwantitatieve kenmerken. Evans Blue kleurstof kan worden geëxtraheerd uit weefsels door het incuberen van een bepaalde hoeveelheid weefsel in formamide. Evans Blue absorptiemaximum is bij 620 nm en absorptie minimum is 740 nm. Door een standaardcurve voor Evans Blue, kunnen optische densiteitsmetingen worden omgezet in milligram kleurstof per gevangen milligram weefsel. Statistische analyse worden gebruikt om significante verschillen in vasculaire permeabiliteit beoordelen.
Introduction
Vorming en instandhouding van selectieve permeabele barrières essentieel zijn voor het orgaanontwikkeling en prestaties 1,2. Endotheelcellen lijn het bloedvatlumen en vormen een semi-permeabele barrière die essentieel in het selectieve transport tussen bloed en de interstitiële ruimte van alle organen. Een adequate barrière wordt gehandhaafd door nauwe cel-cel verbindingen die streng worden gecontroleerd door groeifactoren, cytokines en andere stress gerelateerde moleculen 3. Verstoring van de endotheliale barrière kan resulteren in verhoogde permeabiliteit en vasculair lekken. Deze effecten worden gezien bij diverse ziektebeelden en het begrip van de onderstreping moleculaire signalering vereist multidisciplinaire methoden 4,5. In dit artikel beschrijven we een in vivo methode om vat permeabiliteit met behulp van een muis-model te meten.
De assay we beschrijven, ook bekend als Miles assay is een goed establchine methode vasculaire permeabiliteit in vivo te testen. De assay is gebaseerd op het feit dat, onder basale fysiologische omstandigheden albumine niet de endotheliale barrière. Evans Blue, een azokleurstof met hoge affiniteit voor albumine, geïnjecteerd in de bloedstroom van een proefdier, onder fysiologische omstandigheden wordt verwacht te worden beperkt binnen bloedvaten. Wanneer een vasculaire permeabiliteit stimulus wordt toegevoegd, lokaal of systemisch, bloedvaten gaan lekken eiwit en dus ook de Evans blauwe die is gebonden aan albumine. Dit resulteert in een snelle blauwe kleuring van weefsels die doorlatend schepen.
Succesvolle injectie van de kleurstof in de muis laterale staartader is essentieel voor de goede afloop van het experiment. Staartader injectie techniek vereist veel oefening en moeten voor worden beheerst het starten van het experiment.
Vaartuig permeabiliteit is sterk afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van de eeniMAL, dus bij het vergelijken van verschillende muizenstammen is het noodzakelijk dat de muizen of andere proefpersonen hebben bijna identieke geboortedata en gewicht. Andere factoren die de doorlaatbaarheid van de endotheliale barrière beïnvloeden zijn omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid, en zeer belangrijk, de behandeling stress van de muis. Vanwege het grote aantal factoren die de uitkomst van het experiment kunnen beïnvloeden is het altijd wenselijk dat de experiment wordt herhaald ten minste driemaal en statistische analyse uitgevoerd.
Deze test kan worden gebruikt of vaartuig permeabiliteit van muizen die genetisch gemodificeerd zijn, en muizen met verschillende genetische achtergronden vergelijken. Permeabiliteit kan worden beoordeeld in de aanwezigheid of afwezigheid van een stimulus, afhankelijk van de functie van het gen dat is gemoduleerd. Deze test kan ook worden gebruikt of om het effect van verschillende verbindingen op vaartuig permeabiliteit testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vasculaire permeabiliteit is een kritische marker voor bloedvat status. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond aanwezig zijn in verschillende systemische ziekten, zoals diabetes, hypertensie en auto-immuunziekten 6,7,8. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond worden gemedieerd door schuifspanning, groeifactoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor en fibroblastgroeifactor, ontstekingsmediatoren zoals serotonine, histamine en bradykinine 9. Extravasatie van water en kleine …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
Riferimenti
- Beck, K. F., et al. Inducible NO synthase: role in cellular signaling. J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).
- Bertglia, S., Giusti, A. Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs. J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).
- Weis, S. M. Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer. Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).
- Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation. Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).
- Viazzi, F., et al. Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension. Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).
- Scheppke, ., et al. Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits. J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).
- Blanchet, M. R., et al. Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability. J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).
- Dvorak, A. M. Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle. Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).
- Le Guelte, A., Gavard, J. Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability. Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human “endothelium”. Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).
