En<em> In vivo</em> Assay til Test Blood Vessel Permeabilitet

Summary

Vi presenterer en<em> In vivo</em> Analyse for å teste blodkar permeabilitet. Denne analysen er basert på intravenøs injeksjon av et fargestoff og påfølgende visualisering av diffusjon sin inn mellomrommene.

Abstract

Denne metoden er basert på den intravenøse injeksjon av Evans Blue i mus som testen dyremodell. Evans blå er et fargestoff som binder albumin. Under fysiologiske betingelser endotelet er ugjennomtrengelig til albumin, så Evans Blue bundet albumin restene begrenset innenfor blodkar. I patologiske forhold som fremmer øket vaskulær permeabilitet endotelceller delvis miste sine nære kontakter og endotelet blir gjennomtrengelig for små proteiner som albumin. Denne tilstanden tillater ekstravasasjon av Evans Blue i vev. En sunn endothelium hindrer ekstravasering av fargestoffet i de nærliggende vaskularisert vev. Organer med økt permeabilitet vil vise betydelig blå farge i forhold til organer med intakt endotel. Nivået av vaskulær permeabilitet kan vurderes ved enkle visualisering eller ved kvantitativ måling av fargestoffet innlemmet per milligram vev av kontroll versus forsøksdyr / vev. To powerful aspekter ved denne analysen er dens enkelhet og kvantitative karakteristika. Evans Blue fargestoff kan utvinnes fra vev ved inkubering av en bestemt mengde vev i formamid. Evans Blue absorbans maksimum er på 620 nm og absorbans minimum er ved 740 nm. Ved å bruke en standard kurve for Evans Blue, kan optiske tetthetsmålinger bli omdannet til milligram fargestoff fanget per milligram av vev. Statistisk analyse bør brukes til å vurdere signifikante forskjeller i permeabilitet.

Introduction

Dannelse og vedlikehold av selektive permeable barrierer er avgjørende for riktig organ utvikling og ytelse ^1,2. Endotelceller linje blodkaret lumen og danne en semi-permeabel barriere som er vesentlig i selektiv transport mellom blod og den interstitielle rommet av alle organer. En tilstrekkelig permeabilitet barriere opprettholdes gjennom trange celle-til-celle kryss som er strengt kontrollert av vekstfaktorer, cytokiner og andre stressrelaterte molekyler ^3. Forstyrrelse av endotelcelle barriere kan føre til økt permeabilitet og vaskulær lekkasje. Disse effektene er sett i ulike sykdomstilstander og forståelse av understrekingen molekylære signaler krever tverrfaglig metoder ^4,5. I denne artikkelen beskriver vi en di vivo metode for å måle fartøyets permeabilitet ved hjelp av en mus modell.

Analysen vi beskriver, også kjent som Miles analysen, er en godt established metode for å teste vaskulær permeabilitet in vivo. Forsøket er basert på det faktum at under basale fysiologiske betingelser, ikke albumin ikke krysse endoteliale barrieren. Evans Blue, et azo fargestoff med høy affinitet for albumin, blir injisert i blodstrømmen av et forsøksdyr, og under fysiologiske betingelser, er det forventet å være begrenset i blodkar. Når en vaskulær permeabilitet stimulans tilsettes enten topisk eller systemisk, blodkar begynner å lekke protein og således, også Evans blått som er bundet til albumin. Dette resulterer i en hurtig blålig farge av vev som har permeable fartøy.

Vellykket injeksjon av fargestoffet i musen lateral halevenen er kritisk for godt resultat av forsøket. Halevenen injeksjonsteknikk trenger omfattende praksis og bør mestret før start av eksperimentet.

Fartøy permeabilitet er avhengig av alder og vekten av enimal, så når man sammenligner ulike musestammer er det viktig at de mus eller andre forsøkspersoner har nærmere identiske fødselsdatoer og vekt. Andre faktorer som påvirker permeabilitet endothelial barrieren er miljømessige forhold som temperatur, fuktighet, og svært viktig, håndtering stress av musen. På grunn av de mange faktorene som kan påvirke utfallet av eksperimentet er det alltid tilrådelig at forsøket gjentas minst tre ganger og statistisk analyse utført.

Denne analysen kan brukes eller sammenligne fartøy permeabilitet av mus som er blitt genetisk modifisert, samt mus med ulike genetiske bakgrunn. Permeabilitet kan vurderes i nærvær eller fravær av en stimulans, avhengig av funksjonen av genet som er modulert. Denne analysen kan også bli brukt, eller å teste effekten av forskjellige forbindelser på fartøyet permeabilitet.

Protocol

1. Intravenøs injeksjon av Evans Blue i Mouse Lateral halevenen Forberede en 0,5% steril løsning av Evans blå i PBS. Om nødvendig, filter-sterilisere løsningen for å fjerne eventuelle partikler som ikke har løst seg opp. Aspirer 200 ul Evans Blue løsning i en sprøyte. Unngå alle luftbobler som kan ha rømt inn i sprøyten. Sted mus som er 8-12 uker gamle i en tilbakeholdenhet enheten slik at dyret ikke er fritt mobil, men halen kan håndteres. Plasser musen tilbakeholde…

Representative Results

Vi brukte en in vivo permeabilitet analyse for å teste fartøyet lekkasje i mus 8-12 uker gamle. Denne testen er nyttig i å sammenligne den relative permeabilitet mellom dyr av forskjellig genetisk bakgrunn eller i en enkelt stamme av mus utsatt for behandlinger som påvirker vaskulatur. Våre resultater viser at en stamme av genmodifiserte mus vi opprettet i vårt laboratorium har en mer gjennomtrengelig endotel sammenlignet med vill-type mus. Disse endringene er tydelig ved makroskopisk nivå i man…

Discussion

Vaskulær permeabilitet er en kritisk markør for blodkar status. Økt vaskulær permeabilitet er vist å være til stede i flere systemiske sykdommer, som diabetes, hypertensjon og autoimmune sykdommer ^6,7,8. Økt vaskulær permeabilitet er vist å være mediert av skjærspenning, vekstfaktorer som vaskulær endotelial vekstfaktor og fibroblast vekstfaktor, inflammatoriske mediatorer som serotonin, histamin og bradykinin ^9. Ekstravasasjon av vann og små molekyler er tenkt å skje gjennom små åp…

Materials

			REAGENT
EVANS BLUE	SIGMA	E2129
FORMAMIDE	INVITROGEN	15515-026
PBS			0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4
			EQUIPMENT
SPECTROPHOTOMETER	EPPENDORF	952000006
MOUSE RESTRAINT DEVICE	HARVARD APPARATUS	340012
SYRINGE	BD	309659
NEEDLES	BD	305106	The gauge of the needle depends on the size of the animal.
BALANCE	DENVER INSTRUMENT	TP-64