En<em> In vivo</em> Analys för att testa Permeabilitet blodkärl

Summary

Vi presenterar en<em> In vivo</em> Analys för att testa permeabiliteten blodkärl. Denna analys är baserad på intravenös injektion av ett färgämne och efterföljande visualisering av dess diffusion in mellanrum.

Abstract

Denna metod är baserad på den intravenösa injektionen av Evans Blue i möss som provningen djurmodell. Evans-blått är en färg som binder albumin. Under fysiologiska förhållanden endotelet är ogenomtränglig för albumin, så Evans Blue bundna albumin fortfarande begränsad inom blodkärl. I patologiska förhållanden som främjar ökad vaskulär permeabilitet endotelceller delvis förlorar sina nära kontakter och endotelet blir permeabel för små proteiner såsom albumin. Detta tillstånd medger extravasation av Evans Blue i vävnader. En frisk endotel förhindrar extravasation av färgämnet i de närliggande vaskulariserade vävnader. Organ med ökad permeabilitet visar signifikant ökad blåfärgning jämfört med organ med intakt endotel. Nivån av vaskulär permeabilitet kan bedömas genom enkel visualisering eller genom kvantitativ mätning av färgämnet införlivat per milligram vävnad av kontroll kontra försöksdjur / vävnad. Två Powerful aspekter av denna analys är dess enkelhet och kvantitativa egenskaper. Evans Blue kan extraheras från vävnader genom att inkubera en specifik mängd vävnad i formamid. Evans Blue absorbansmaximum är 620 nm och absorbansen minst är 740 nm. Genom att använda en standardkurva för Evans Blue, kan optiska densitetsmätningar omvandlas till milligram färgämne fångas per milligram vävnad. Statistisk analys bör användas för att bedöma signifikanta skillnader i vaskulär permeabilitet.

Introduction

Bildning och underhåll av selektiva permeabla barriärer är nödvändig för korrekt orgel utveckling och resultat ^1,2. Endotelceller linje lumen blodkärlet och bildar en semi-permeabel barriär som är viktigt i den selektiva transporten mellan blod och det interstitiella utrymmet för alla organ. En adekvat permeabilitetsbarriär upprätthålls genom trånga cell-till-cell-korsningar som strängt kontrolleras av tillväxtfaktorer, cytokiner och andra stressrelaterade molekyler ^3. Rubbning av endotelcell barriären kan resultera i ökad permeabilitet och vaskulär läckage. Dessa effekter kan ses i olika sjukdomstillstånd och förståelsen av understrykningen molekylär signalering kräver tvärvetenskapliga metoder ^4,5. I den här artikeln beskriver vi en in vivo metod för att mäta fartygets permeabilitet med en musmodell.

Analysen vi beskriver, även känd som Miles analys är en väl Etablished metod för att testa vaskulär permeabilitet in vivo. Analysen är baserad på det faktum att under basala fysiologiska förhållanden, inte albumin inte korsa endoteliala barriären. Evans Blue, ett azofärgämne med hög affinitet för albumin, injiceras i blodomloppet av ett försöksdjur, och under fysiologiska betingelser, förväntas vara begränsad inom blodkärl. När en vaskulär permeabilitet stimulans tillsätts, antingen topiskt eller systemiskt, blodkärl börjar läcka protein och därmed även Evans blå som är bundet till albumin. Detta resulterar i en snabb blåaktig färgning av vävnader som har permeabla fartyg.

Framgångsrik injektion av färgämnet i mus laterala svansvenen är avgörande för bra resultat av experimentet. Svansveninjektion teknik kräver omfattande praxis och bör bemästras innan du startar experimentet.

Kärl permeabilitet är starkt beroende på ålder och vikt av enimal så när man jämför olika musstammar är det absolut nödvändigt att de möss eller andra försökspersoner har nära identiska födelsedatum och vikt. Andra faktorer som påverkar permeabiliteten för endoteliala barriären är miljöfaktorer såsom temperatur, fuktighet, och mycket viktigt, hantering stress musen. På grund av de många faktorer som kan påverka resultatet av experimentet är det alltid klokt att experimentet upprepas minst tre gånger och statistisk analys.

Denna analys kan användas eller för att jämföra fartyg permeabilitet hos möss som är genetiskt modifierade, samt möss med olika genetiska bakgrunder. Permeabilitet kan bedömas i närvaro eller frånvaro av ett stimulus, beroende på funktionen av genen som är modulerad. Denna analys kan också användas eller för att testa effekten av olika föreningar på fartyg permeabilitet.

Protocol

1. Intravenös injektion av Evans Blue i mus laterala svansvenen Bered en 0,5% steril lösning av Evans blått i PBS. Om nödvändigt, filter-sterilisera lösningen för att avlägsna eventuella partiklar som inte har lösts upp. Aspirera 200 pl Evans Blue lösning i en spruta. Undvik alla luftbubblor som kan ha undgått i sprutan. Placera möss som är 8-12 veckor gamla i en kvarhållande anordning så att djuret inte fritt rörlig men svansen kan hanteras. Placera enheten musen…

Representative Results

Vi använde en in vivo permeabilitet test för att testa fartygets läckage i möss 8-12 veckor gamla. Detta test är användbart vid jämförelse av den relativa vaskulära permeabiliteten mellan djur av olika genetisk bakgrund eller i en enda stam av möss som utsatts för behandlingar som påverkar vaskulaturen. Våra resultat visar att en stam av genetiskt modifierade möss som vi skapat i vårt labb har en mer genomsläpplig endotel än vildtyp möss. Dessa förändringar är uppenbara på makroskopisk niv…

Discussion

Vaskulär permeabilitet är en kritisk markör för blodkärl status. Ökad vaskulär permeabilitet har visat sig vara närvarande i flera systemiska sjukdomar, däribland diabetes, högt blodtryck, och autoimmuna sjukdomar ^6,7,8. Ökad vaskulär permeabilitet har visat vara förmedlad av skjuvspänning, tillväxtfaktorer såsom vaskulär endotelial tillväxtfaktor och fibroblasttillväxtfaktor, inflammatoriska mediatorer som serotonin, histamin och bradykinin ^9. Extravasering av vatten och små mo…

Materials

			REAGENT
EVANS BLUE	SIGMA	E2129
FORMAMIDE	INVITROGEN	15515-026
PBS			0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4
			EQUIPMENT
SPECTROPHOTOMETER	EPPENDORF	952000006
MOUSE RESTRAINT DEVICE	HARVARD APPARATUS	340012
SYRINGE	BD	309659
NEEDLES	BD	305106	The gauge of the needle depends on the size of the animal.
BALANCE	DENVER INSTRUMENT	TP-64