Ein<em> In vivo</em> Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung
Summary
Wir präsentieren ein<em> In vivo</em> Assay Blutgefäß Durchlässigkeit zu testen. Dieser Assay basiert auf intravenöse Injektion eines Farbstoffes und nachfolgender Visualisierung dessen Diffusion in Zwischenräume basiert.
Abstract
Dieses Verfahren basiert auf der intravenösen Injektion von Evans Blue in Mäusen als Versuchstiere Modell. Evans Blau ist ein Farbstoff, der Albumin bindet. Unter physiologischen Bedingungen das Endothel ist undurchlässig für Albumin, so Evans blue gebundene Albumin Überreste innerhalb von Blutgefäßen beschränkt. In pathologischen Bedingungen, die erhöhte Gefäßpermeabilität Endothelzellen fördern teilweise verlieren ihren engen Kontakt und das Endothel durchlässig wird, um kleine Proteine wie Albumin. Dieser Zustand ermöglicht Extravasation von Evans Blue in den Geweben. Eine gesunde Endothel verhindert Extravasation des Farbstoffs in den benachbarten vaskularisierten Geweben. Organe mit einer erhöhten Permeabilität deutlich erhöht Blaufärbung Vergleich zu Organen mit intaktem Endothel zeigen. Das Niveau der Gefäßpermeabilität kann durch einfache Visualisierung oder durch quantitative Messung der Farbstoff pro Milligramm Gewebe Kontrolle gegenüber Versuchstier / Gewebe eingebaut beurteilt werden. Zwei powerful Aspekte dieses Assays sind seine Einfachheit und quantitativen Merkmalen. Evans Blau-Farbstoff kann aus Geweben, die durch Inkubieren eines bestimmten Menge an Gewebe in Formamid extrahiert werden. Evans Blue Absorptionsmaximum liegt bei 620 nm und Absorption Minimum bei 740 nm auf. Durch die Verwendung einer Standardkurve für Evans Blue, können Messungen der optischen Dichte in Milligramm Farbstoff pro Milligramm Gewebe eingefangen umgewandelt werden. Statistische Analyse sollte verwendet werden, um signifikante Unterschiede in Gefäßpermeabilität zu beurteilen.
Introduction
Bildung und Erhaltung der selektiven permeablen Barrieren für die richtige Entwicklung der Organe und Leistung 1,2 unerlässlich. Endothelzellen Linie das Blutgefäßlumen und bilden eine semi-permeable Barriere, die wesentlich in den selektiven Transport zwischen Blut und dem interstitiellen Raum aller Organe ist. Eine ausreichende Permeabilitätsbarriere wird durch enge Zell-zu-Zell-Verbindungen, die ausschließlich durch Wachstumsfaktoren, Zytokine und andere stressbedingte Moleküle 3 gesteuert werden beibehalten. Störung der Endothelzelle Barriere kann in erhöhter Permeabilität und vaskuläre Leckage führen. Diese Effekte sind in verschiedenen Krankheitsstadien gesehen und das Verständnis der Unterstreichung molekularen Signalwegen erfordert multidisziplinäre Methoden 4,5. In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren zur In-vivo-Verwendung eines Gefäßpermeabilität Mausmodell messen.
Der Assay wir beschreiben, auch als Miles-Assay bezeichnet, ist ein gut establIshed Methode, um vaskuläre Permeabilität in vivo zu testen. Der Assay basiert auf der Tatsache, dass unter basalen physiologischen Bedingungen, Albumin passiert nicht die Endothelbarriere basiert. Evans Blue, ein Azofarbstoff mit hoher Affinität für Albumin, wird in den Blutstrom eines Versuchstiers injiziert werden, und unter physiologischen Bedingungen, so wird erwartet, dass sie innerhalb von Blutgefäßen beschränkt werden. Wenn ein Gefäßpermeabilität Reiz hinzugefügt wird, entweder lokal oder systemisch, beginnen die Blutgefäße zu Protein auslaufen und damit auch die Evans Blau, das an Albumin gebunden ist. Dies führt zu einem raschen bläuliche Färbung von Geweben durchlässigen Behälter haben.
Erfolgreiche Injektion des Farbstoffes in der Maus laterale Schwanzvene ist entscheidend für die gute Ergebnis des Experiments. Schwanzveneninjektion Technik erfordert umfangreiche Praxis und sollte vor dem Start des Experiments gemeistert werden.
Gefäßpermeabilität ist stark abhängig von dem Alter und dem Gewicht des eineimal, so beim Vergleich verschiedener Mausstämmen ist es unerlässlich, dass die Mäuse oder andere Probanden nahezu identisch Geburtsdaten und Gewicht haben. Andere Faktoren, die die Durchlässigkeit der Endothelbarriere beeinflussen Umgebungsbedingungen wie Temperatur, Feuchtigkeit, was sehr wichtig, die Handhabung Stress der Maus. Aufgrund der Vielzahl von Faktoren, die das Ergebnis des Experiments beeinflussen kann es immer ratsam, dass das Experiment wiederholt wird mindestens dreimal und statistische Analysen durchgeführt.
Dieser Assay kann oder verwendet werden, um Gefäßpermeabilität von Mäusen, die gentechnisch verändert wurden, sowie Mäuse mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen vergleichen. Permeabilität kann in Gegenwart oder Abwesenheit eines Reizes bewertet werden, in Abhängigkeit von der Funktion des Gens, das moduliert ist. Dieser Assay kann auch verwendet werden, oder um die Wirkung von unterschiedlichen Verbindungen auf Gefäßpermeabilität testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gefäßpermeabilität ist ein kritischer Marker für Blutgefäß-Status. Erhöhte Gefäßpermeabilität hat sich gezeigt, dass in mehreren systemischen Erkrankungen, wie Diabetes, Hypertension, und Autoimmunerkrankungen 6,7,8 vorliegt. Erhöhte Gefäßpermeabilität ist gezeigt worden, durch Scherbeanspruchung vermittelt werden, Wachstumsfaktoren wie vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Entzündungsmediatoren wie Serotonin, Histamin und Bradykinin 9. Extravasa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health, R01CA142928 unterstützt.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
Riferimenti
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