Un<em> In vivo</emTest> Tester la perméabilité des vaisseaux sanguins
Summary
Nous présentons une<em> In vivo</em> Test afin de tester la perméabilité des vaisseaux sanguins. Ce test est basé sur l'injection intraveineuse d'un colorant et visualisation ultérieure de sa diffusion dans les espaces interstitiels.
Abstract
Cette méthode est basée sur l'injection intraveineuse de bleu d'Evans dans la souris comme modèle animal d'essai. Bleu Evans est un colorant qui se lie albumine. Dans les conditions physiologiques de l'endothélium est imperméable à l'albumine, de sorte Evans bleus assortis de restes d'albumine limitée dans les vaisseaux sanguins. Dans des conditions pathologiques qui favorisent l'augmentation des cellules endothéliales vasculaires perméabilité partiellement perdent leurs contacts étroits et l'endothélium devient perméable à de petites protéines comme l'albumine. Cette condition permet d'extravasation de bleu d'Evans dans les tissus. Un endothélium sain empêche extravasation du colorant dans les tissus vascularisés voisins. Organes ayant une perméabilité accrue montrera nettement augmenté par rapport à coloration bleue des organes avec endothélium intact. Le niveau de perméabilité vasculaire peut être évaluée par simple visualisation ou par mesure quantitative du colorant constituée par milligramme de tissu de contrôle par rapport à des animaux d'expérimentation / tissu. Deux PoweRFUL aspects de ce test sont sa simplicité et caractéristiques quantitatives. Colorant bleu Evans peut être extrait à partir de tissus en incubant une quantité spécifique d'un tissu en le formamide. Maximale d'absorbance Evans Blue est à 620 nm et un minimum d'absorption est à 740 nm. À l'aide d'une courbe d'étalonnage pour le bleu Evans, mesures de densité optique peut être transformé en colorant milligramme capturé par milligramme de tissu. L'analyse statistique doit être utilisée pour évaluer des différences significatives dans la perméabilité vasculaire.
Introduction
Formation et le maintien des barrières perméables sélectives sont essentiels pour le développement des organes appropriée et 1,2 performance. Les cellules endothéliales tapissent la lumière des vaisseaux sanguins et de former une barrière semi-perméable qui est essentiel dans le transport sélectif entre le sang et l'espace interstitiel de tous les organes. Une barrière de perméabilité suffisante est maintenue par serrées cellule à cellule jonctions qui sont strictement contrôlées par des facteurs de croissance, des cytokines et des molécules de stress autres produits 3. Rupture de la barrière de cellules endothéliales peut entraîner une plus grande perméabilité et une fuite vasculaire. Ces effets sont observés dans divers états pathologiques et la compréhension de la signalisation moléculaire souligner nécessite des méthodes pluridisciplinaires 4,5. Dans cet article, nous décrivons une méthode in vivo pour mesurer la perméabilité des vaisseaux en utilisant un modèle de souris.
Le test que nous décrivons, également connu sous le nom d'analyse Miles, est un bien établMINE Procédé pour tester la perméabilité vasculaire in vivo. Le test est basé sur le fait que, dans des conditions physiologiques basales, l'albumine ne traverse pas la barrière endothéliale. Bleu d'Evans, un colorant azoïque avec une forte affinité pour l'albumine, est injecté dans le flux sanguin d'un animal expérimental, et dans des conditions physiologiques, il est prévu d'être limité à l'intérieur des vaisseaux sanguins. Lorsqu'un stimulus perméabilité vasculaire est ajouté, par voie topique ou systémique, les vaisseaux sanguins commencent à couler protéine et donc, aussi le bleu Evans qui est lié à l'albumine. Cela se traduit par une coloration bleutée des tissus rapide dont les navires perméables.
Injection réussie du colorant dans la veine de la queue de la souris latéral est essentiel pour la bonne réussite de l'expérience. Technique d'injection queue veine exige de la pratique approfondie et doivent être maîtrisées avant de commencer l'expérience.
La perméabilité des vaisseaux est fortement dépendante de l'âge et du poids de l'unimal, donc lorsque l'on compare différentes souches de souris, il est impératif que les souris ou les sujets de test ont d'autres proches de la date de naissance et le poids identiques. Parmi les autres facteurs qui influent sur la perméabilité de la barrière endothéliale sont des conditions environnementales comme la température, l'humidité, et c'est très important, le stress de manipulation de la souris. En raison de la multitude de facteurs qui peuvent influencer le résultat de l'expérience, il est toujours conseillé que l'expérience est répétée au moins trois fois et l'analyse statistique effectuée.
Ce test peut être utilisé ou pour comparer la perméabilité des vaisseaux de souris qui ont été génétiquement modifiés, ainsi que les souris de différentes origines génétiques. On peut évaluer la perméabilité à la présence ou l'absence d'un stimulus, en fonction de la fonction du gène qui est modulé. Ce test peut également être utilisé ou pour tester l'effet de différents composés sur la perméabilité des vaisseaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perméabilité vasculaire est un marqueur essentiel pour l'état des vaisseaux sanguins. Augmentation de la perméabilité vasculaire a été montré pour être présent dans plusieurs maladies systémiques telles que le diabète, l'hypertension et les maladies auto-immunes 6,7,8. Augmentation de la perméabilité vasculaire a été montré pour être médiée par la contrainte de cisaillement, des facteurs de croissance tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire et le facteur de cro…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Institutes of Health, R01CA142928.
Materials
| REAGENT | |||
| EVANS BLUE | SIGMA | E2129 | |
| FORMAMIDE | INVITROGEN | 15515-026 | |
| PBS | 0.2M Phosphate 1.5M NaCl pH 7.4 |
||
| EQUIPMENT | |||
| SPECTROPHOTOMETER | EPPENDORF | 952000006 | |
| MOUSE RESTRAINT DEVICE | HARVARD APPARATUS | 340012 | |
| SYRINGE | BD | 309659 | |
| NEEDLES | BD | 305106 | The gauge of the needle depends on the size of the animal. |
| BALANCE | DENVER INSTRUMENT | TP-64 |
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