स्तनधारी कोशिकाओं में endoplasmic जालिका स्थानीयकृत mRNAs का विज़ुअलाइज़ेशन
Summary
यहाँ हम एक स्तनधारी टिशू कल्चर कोशिकाओं में endoplasmic जालिका जुड़े mRNAs कल्पना विधि का वर्णन है. यह तकनीक digitonin के साथ प्लाज्मा झिल्ली की चयनात्मक permeabilization शामिल cytoplasmic फ्लोरोसेंट द्वारा पीछा सामग्री हटाने<em> स्वस्थानी में</em> के लिए या तो थोक पाली (ए) mRNA या विशिष्ट टेप का पता लगाने के संकरण.
Abstract
Eukaryotes में, दूत (mRNAs) RNAs कि secreted और झिल्ली प्रोटीन endoplasmic जालिका (ईआर) की सतह स्थानीयकृत हैं सांकेतिक शब्दों में बदलना के अधिकांश. हालांकि, इन mRNAs के दृश्य चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यह विशेष रूप से सच है जब mRNA की केवल एक अंश ईआर से जुड़े है और उनके इस organelle से वितरण गैर लक्षित टेप (यानी "मुक्त") द्वारा बाधित है. आदेश में ईआर जुड़े mRNAs पर नजर रखने के लिए, हम एक विधि है जो कोशिकाओं में एक digitonin निष्कर्षण समाधान है कि चुनिंदा प्लाज्मा झिल्ली permeabilizes एक कम जोखिम के साथ व्यवहार कर रहे हैं विकसित किया है, और इस प्रकार cytoplasmic सामग्री को हटा है, जबकि एक साथ ईआर की अखंडता को बनाए रखने . जब इस विधि स्वस्थानी संकरण (मछली) में फ्लोरोसेंट के साथ मिलकर किया है, एक स्पष्ट रूप से फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ईआर बाध्य mRNAs कल्पना कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग या तो थोक पाली (A) टेप या विशिष्ट mRNAs ईआर एसोसिएशन की डिग्री मूल्यांकन किया जा सकता हैऔर भी मात्रा. इस प्रक्रिया में एक इस परख का उपयोग के mRNA ईआर बातचीत की प्रकृति की जांच कर सकते हैं.
Introduction
Eukaryotes में, mRNA एन्कोडिंग secreted और झिल्ली प्रोटीन संकेत मान्यता कण 1,2 सह translationally ईआर लक्षित किया जा सकता है और 3,4 अनुवाद के दौरान ribosomes और translocons के बीच प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से ईआर पर बनाए रखा जा सकता है. बहरहाल, चाहे mRNAs और लक्षित किया जा सकता है या तो ribosomes या अनुवाद की ईआर स्वतंत्र पर बनाए रखा बहुत हाल ही में जब तक स्पष्ट नहीं था. पिछले अध्ययनों से पता करने का प्रयास करने के लिए पता है कि वहाँ अनुवाद स्वतंत्र ईआर सेलुलर fractionation तकनीक का उपयोग करने के साथ mRNA संघ है. क्योंकि रासायनिक कठोर शर्तों ईआर प्राप्त vesicles, है जो संभावित नाजुक mRNA ईआर संघ को बाधित हो सकता है से राइबोसोम को अलग करने के लिए आवश्यक थे, इन अध्ययनों अनिर्णायक थे, 5-8 के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने और 9,10 के खिलाफ ribosomal स्वतंत्र mRNA की ईआर प्रस्तोता .
इन समस्याओं को दरकिनार करने के लिए हम एक आद्य विकसित किया हैकर्नल को अलग करने के लिए और ईआर mRNAs बाध्य छवि. इस प्रक्रिया में एक हल्के निष्कर्षण इलाज है, जो प्रभावी रूप से सेल (गैर ईआर ही mRNAs सहित) के सभी cytoplasmic सामग्री को हटा जबकि एक साथ ईआर morphology और उसके जुड़े अणुओं के सभी के संरक्षण शामिल है. हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर दिखा दिया है कि mRNAs की एक सबसेट लक्षित कर रहे हैं और फिर स्वतंत्र रूप से ribosomes या अनुवाद 11 ईआर पर बनाए रखा.
Protocol
Representative Results
Discussion
mRNAs की विभिन्न subcellular साइटों के लिए स्थानीयकरण, mRNA स्थानीयकरण प्रोटीन के साथ टेप की बातचीत के माध्यम से, अपने अंतिम गंतव्य के लिए प्रोटीन की उचित छँटाई के लिए, और जीन अभिव्यक्ति की ठीक ट्यूनिंग के लिए एक व्य?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम XAC और एएफपी के लिए राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
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