哺乳動物細胞における小胞体ローカライズされたmRNAの可視化
Summary
ここでは、哺乳類の組織培養細胞に小胞体関連mRNAを可視化する方法を説明します。この手法は、蛍光灯に続く細胞質の内容を削除するジギトニンと形質膜の選択的透過性上昇を伴う<em>その場で</emどちらバルクポリ（A）mRNAまたは特定の転写産物を検出するために>ハイブリダイゼーション。
Abstract
真核生物では、分泌され、膜タンパク質は小胞体（ER）の表面に局在しているエンコードのメッセンジャーRNA（mRNA）のほとんど。しかし、これらのmRNAの可視化が困難な場合があります。これは、mRNAの一部のみがER関連のときは特にそうであり、この細胞小器官への分布は非標的（ すなわち "自由"）転写産物は妨害されます。同時に、ERの整合性を保ちながら、ER関連mRNAを監視するために、我々は、細胞が選択的に細胞膜をpermeabilizesジギトニン抽出溶液に短い露光で処理させる方法を開発し、したがって細胞質内容が削除されました。このメソッドはin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inと結合されているとき、1は明らかに蛍光顕微鏡で、ERに結合したmRNAを可視化することができます。このプロトコルを使用してバルク·ポリ（A）転写産物または特定のmRNAのいずれかのためにER-関連度を評価することができるさらに定量化した。プロセスでは、1は、mRNA-ERの相互作用の性質を調べるために、このアッセイを使用することができます。
Introduction
真核生物では、コードするmRNAは、翻訳時の3,4リボソームとtransloconsの間の直接的な相互作用を介して分泌され、膜タンパク質は、共同翻訳シグナル認識粒子1,2によってERに標的とすることができるし、ERに保持することができる。しかし、mRNAはごく最近まで不明であったリボソームや翻訳のいずれかの独立した小胞体に標的にし、維持することができるかどうかを指定します。これまでの研究では、細胞分画技術を用いて、ERでの翻訳に依存しないmRNAの関連があるかどうかを対処しようとしました。過酷な化学的条件は潜在的に繊細なmRNAの小胞体関連が中断される可能性があり、ER由来の小胞から、リボソームの関連付けを解除する必要がありましたので、これらの研究では、5月8日のための証拠を提供する、決定的なものではなかったと9,10に対してリボソーム依存しないmRNAのERへのアンカリング。
これらの問題を回避するために、我々はprotoを開発しました小胞体に結合したmRNAを単離すると、画像にCOL。この手順では、同時に、ER形態とその関連分子のすべてを保持しながら、効果的に細胞（非小胞体に結合したmRNAを含む）のすべての細胞質のコンテンツを削除し、軽度抽出処理を伴う。このプロトコルを使用して私たちは、mRNAのサブセットを対象としており、その後、リボソームまたは翻訳を11の独立して、ERに保持されていることを実証した。
Protocol
Representative Results
Discussion
様々な細胞内のサイトへのmRNAの局在化は、mRNA局在タンパク質と転写産物の相互作用を介して、細胞内のローカルな要件への彼らの最終目的地へのタンパク質が適切にソートするため、遺伝子発現の微調整のための重要な広範な現象である地域19,20。
ここに記載のアッセイを用いて、我々は、分泌タンパク質をコードするmRNAがリボソームや翻訳の存在下または非?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、XACとAFPに国立科学カナダ工学研究評議会からの補助金によって支えられて
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