Summary
En fremgangsmåde til kvantitativt at vurdere den kemotaktiske reaktion af<em> Caenorhabditis elegans</em> Beskrives. En kemotaktiske indeks (CI) blev ansat som en måde at præcist vurdere respons af orme, at visse mål, og tjene som en platform for sammenligning mellem stammer og forbindelser af interesse.
Abstract
Mange organismer bruger chemotaxis at opsøge fødekilder, undgå skadelige stoffer, og finde kammerater. Caenorhabditis elegans har imponerende chemotaxis adfærd.
Udgangspunktet bag teste respons orme til et lugtstof er at placere dem i et område, og observere bevægelsen fremkaldes som reaktion på et lugtstof. Selv med de mange tilgængelige analyser fortsat optimering ormen begynder placering i forhold til både kontrol og test områder samtidig minimere interaktionen af orme med hinanden, og samtidig opretholde en betydelig stikprøvestørrelse et arbejde i gang 1-10. Den her beskrevne metode har til formål at løse disse problemer ved at ændre analysen er udviklet af Bargmann et al. 1.. En petriskål er opdelt i fire kvadranter, der to modsatte kvadranter mærket "Test" og to betegnet "Control". Bedøvelsesmiddel er placeret i al test-og kontrolsteder. Ormene er placeret i midten af pladen med en CIRCLe markeret omkring oprindelsen at sikre, at nonmotile orme vil blive ignoreret. Udnytte en fire-kvadrant-system snarere end en 2 eller to 1 eliminerer forspænding i bevægelsen af ormene, da de er lige langt fra test-og kontrolprøver, uanset hvilken side af oprindelsen de begyndte. Dette omgår problemet med orme bliver tvunget til at rejse gennem en klynge af andre orme til at reagere på et lugtstof, hvilket kan forsinke orme eller tvinge dem til at tage en mere omvej, hvilket giver en ukorrekt fortolkning af deres planlagte vej. Denne metode viser også praktiske fordele ved at have en større stikprøve og lade forskeren at køre analysen uden opsyn og score ormene når den tildelte tid er udløbet.
Introduction
Ward først udviklet kemotaksi assay i 1973 5, og siden da har haft vidtrækkende applikationer. Neurobiologi er et felt, der har gavn af anvendelse af en række kemotaxi assays. Olfaktoriske tilpasning, en simpel form for indlæring og hukommelse, er blevet påvist i C. elegans bruger chemotaxis assays 6. De er også blevet anvendt til at vise, at C. elegans kan udvikle ethanol tolerance-et resultat, der ikke kun viser adfærdsmæssige plasticitet af ormene, men som også viser, at ormene kan være meget nyttige i studiet af alkoholafhængighed hos mennesker 3. Assays er endda blevet udviklet til at demonstrere evnen af C. elegans til at gemme kort og lang sigt hukommelse ved at vise, at foreninger er lavet af ormene mellem kemoattraktanter og fødevarer (OP50) 7.. Derudover får de omfattende foreliggende oplysninger vedrørende C. elegans genomet, den chemotaxis adfærd C. elegans er blevet ændret talrige gange ved at inducere mutationer 1,8. Dette giver mulighed for mange spændende tekniske muligheder, såsom udvikling af C. elegans som en bioremediering værktøj. Således, siden den første udvikling af kemotaksi-assay i 1973, er det blevet hyppigt ændret og anvendt til at belyse mysterier i en række forskellige discipliner.
Visse assays til formål at opdage den specifikke rute, som ormene mod et mål. Den prototypiske assay af denne type blev udviklet af Ward 5.. Tre orme blev placeret på smeltet agar til 15 min. Deres bevægelser blev sporet af aftrykket de efterlades som de rejste fra periferien af pladen op en gradient til et tiltrækkende på midten af pladen. Alle orme på pladen blev anholdt under anvendelse af chloroform ved slutningen af hvert forsøg. En efterkommer af denne metode placeres en enkelt orm i midten af pladen med lokkemidler og kontrol ent lige og modsat afstande fra oprindelsen 2.
Gennembore-Shimomura et al. udviklet en assay til at observere den nøjagtige karakter af bevægelsen er involveret i chemotaxis 9.. Individuelle orme blev anbragt i 9 cm petriskåle enten indeholder en ensartet koncentration af lokkemidler eller en radialt formet forløb, der kulminerede i kilden lokkemidler. En computer software program, der anerkendes ormen blev anvendt til at optage den observerede adfærd. Et videokamera fastgjort til et mikroskop sammen med denne fase for at justere petriskålen automatisk assayet løb at sikre ormen forblev i synsfeltet. Fra dette blev mere detaljerede oplysninger opdaget vedrørende årsagen til pirouetter vises ved C. elegans.
Andre analyser, mere ligner den her beskrevne, testede respons af en stor population af orme til testforbindelser. To kvadrant kemotaxi assays har væretbruges til at udforske de roller, de forskellige neuroner, receptorer, og signaltransduktionsmolekyler afspilles, når C. elegans blev udsat for forskellige forbindelser 1.. Mellem 20-50 vaskede orme blev placeret nær centrum af pladen med et tiltrækkende og en kontrol på polære ender sammen med bedøvelsesmiddel, natriumazid (NaN3). Efter 60 min blev en chemotaktisk indeks med værdier fra -1.0 til +1.0 genereret på baggrund af forskellen mellem, hvor mange orme blev anbragt på lokkemidler eller kontrollen. En lignende chemotaktisk indeks blev anvendt i analysen rapporteret i denne artikel, selvom den tidligere assay undladt at strengt evaluere nonmotile orme. Dette assay blev derefter yderligere anvendt til at teste virkningerne af neuronal ablation på kemotaxi.
En anden variation af den ovennævnte assay blev udført, hvor 100-200 orme blev placeret i centrum af en plade indeholdende fire kvadranter 3. Tilstødende kvadranter enten indeholdt testen ellerstyre stof. Som i de foregående assays, blev ormene immobiliseret ved indvirkning af natriumazid før bliver scoret. En lignende fremgangsmåde er beskrevet her som en måde at evaluere reaktion C. elegans til forskellige forbindelser. Men nedenstående metode har den ekstra fordel på kun vurdere orme, der har bestået en tærskel afstanden mellem mobil fra immobile orme.
Andre analyser har indarbejdet lignende retningslinjer for at ignorere immobile orme. Frøkjær-Jensen et al. udviklet en alsidig assay, som kan anvendes til at teste både flygtige og vandopløselige forbindelser 10. En petriskål blev opdelt i fire kvadranter. Den øverste og nederste kvadranter ikke indeholder opløsningsmidler. Den venstre kvadrant indeholdt vand, og retten indeholdt lokkemidler. Ved testning af flygtige lugtstoffer blev analyt placeret på låget af fadet over den rette kvadrant, mens vandopløselige forbindelser blev placeret direkte på agar..
De metoder, i øjeblikket findes til evaluering kemotaktiske respons C. elegans bliver konstant forfinet til at optimere deres brugervenlighed, effektivitet og nøjagtighed. Så mens assayet beskrevet her, har evnen til at vurdere det største antal orme (maksimal kapacitet:. 250 orme / time pr plade, lidt større end gennemløb demonstreret af Lee et al 3), den virkelige styrke ved denne metode er den kortfattet kulminationen af mange af de attributter af tidligere assays (tabel 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Kemotaxi, selvom styres af et komplekst sæt af neuronale og cellulære mekanismer, kan være let og objektivt kvantificeres ved hjælp af kemotaxi assays. For at opnå de bedste resultater fra de analyser, skal visse kritiske trin skal træffes. For det første iscenesættelse ormene er afgørende i giver ensartede eksperimentelle resultater. Worms på forskellige livsstadier opfører sig anderledes 13, så blandede fase orme kan skew eksperimentelle resultater. For det andet sikrer alle E. coli vas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Biovidenskab og fakultetets for Kunst og Videnskab ved Dronningens University for at finansiere dette arbejde. Samt, tak vi Chin-Sang laboratorium for at levere de nødvendige reagenser, udstyr og teknisk support. Vi takker også QGEM 2011, især Tony han for hans bidrag til diskussionen.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH2O to 1 liter.] Autoclave | |||
| PicoFuge | Stratagene | 400552 | |
| Microscopes | Leica | ||
| Dissecting | Leica | ||
| P1000 Pipette | Gilson | ||
| P10 Pipette | Gilson | ||
| 0.5 M Sodium Azide | |||
| Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4] | |||
| Ethanol/Distilled Water | |||
| Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl) | |||
| Agar | Bio-Rad | 166-0600 | |
| NH4Cl | Amresco | CA97062-046 | |
| MOPS | VWR | CA12001-120 | |
| NH4OH | BDH | CABDH8641-2 | |
| 0.25% Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 |
References
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74, 515-527 (1993).
- Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans. Neuron. 7, 729-742 (1991).
- Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. Ethanol preference in C. elegans. Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).
- Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans. Neuron. 14, 803-812 (1995).
- Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays. J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).
- Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans. Cell. 91, 161-169 (1997).
- Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).
- Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 3, e2467 (2008).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Sengupta, P., Bargmann, C. I. Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans. Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).
- Hart, A. C. Behavior. WormBook. , (1895).
