En temps réel l'imagerie en direct de T-signalisation cellulaire Formation Complex
Summary
Nous décrivons une méthode d'imagerie des cellules vivantes qui donne un aperçu de la dynamique des protéines au cours du processus d'activation des lymphocytes T. Nous démontrons l'utilisation combinée de la cellule T test d'épandage, microscopie confocale et analyse d'imagerie pour obtenir des résultats quantitatifs à suivre la signalisation formation du complexe à travers l'activation des lymphocytes T.
Abstract
Protection contre les maladies infectieuses est médiée par le système immunitaire de 1,2. Les lymphocytes T sont des coordinateurs de base du système immunitaire, la régulation de l'activation et de réponses des cellules immunitaires multiples 3,4. Activation des lymphocytes T est fonction de la reconnaissance des antigènes spécifiques affichés par des cellules présentatrices d'antigène (CPA). Le récepteur de l'antigène des cellules T (TCR) est spécifique à chacun des clones de cellules T et détermine la spécificité antigénique 5. La liaison du TCR à l'antigène induit la phosphorylation des composants du complexe TCR. Afin de promouvoir l'activation des lymphocytes T, ce signal doit être transduction de la membrane vers le cytoplasme et le noyau, initiant diverses réponses cruciales telles que le recrutement de protéines de signalisation à la TCR, le site APC (la synapse immunologique), leur activation moléculaire, réarrangement du cytosquelette, l'élévation de la concentration de calcium intracellulaire, et les changements dans l'expression des gènes 6,7. L'exactitude deitiation et la cessation des signaux d'activation est essentielle pour les réponses des lymphocytes T appropriés. L'activité des protéines de signalisation dépend de la formation et de cessation des interactions protéine-protéine, modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation des protéines, la formation de complexes protéiques, ubiquitylation de protéines et le recrutement de protéines à différents sites cellulaires 8. Comprendre les rouages du processus d'activation des lymphocytes T est crucial tant pour la recherche immunologique et les applications cliniques.
Différents tests ont été développés afin d'étudier les interactions protéine-protéine, mais dosages biochimiques, comme la méthode de co-immunoprécipitation largement utilisé, ne permettent pas lieu de protéines pour être discernée, empêchant ainsi l'observation des indications précieuses sur la dynamique du cellulaire des mécanismes. En outre, ces essais en vrac combinent habituellement des protéines de nombreuses cellules différentes qui pourraient être à différents stades de til a étudié processus cellulaire. Cela peut avoir un effet néfaste sur la résolution temporelle. L'utilisation de l'imagerie en temps réel des cellules vivantes permet à la fois le suivi spatial des protéines et la capacité de distinguer temporellement entre les événements de signalisation, donc faire la lumière sur la dynamique du processus de 9,10. Nous présentons une méthode d'imagerie en temps réel de formation de signalisation complexe lors de l'activation des lymphocytes T. T-cellules primaires ou de lignées de cellules T, telles que Jurkat, sont transfectées avec des plasmides codant pour des protéines d'intérêt fusionnées à des protéines fluorescentes monomères, empêchant oligomérisation non physiologique 11. Vivre les cellules T sont déposés sur une lamelle couvre-objet pré-enduit avec un anticorps d'activation des cellules T 8,9, qui se lie au complexe CD3/TCR, induire l'activation des cellules T, tout en surmontant la nécessité d'antigènes d'activation spécifiques. Les cellules activées sont constamment imagés à l'utilisation de la microscopie confocale. données d'imagerie sont analysés pour donner des résultats quantitatifs, tels que le colcoefficient de ocalization des protéines de signalisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
La régulation et la fonction des multiples processus cellulaires dépendent de la formation et de cessation des interactions protéine-protéine. Imagerie microscopique permet le suivi en temps réel des protéines marquées par fluorescence dans les cellules vivantes. Colocalisation de protéines marquées peut suggérer une interaction directe ou indirecte entre les protéines, et peut être utilisée pour renforcer les résultats obtenus par des méthodes biochimiques, comme immunoprécipitation. Contrairement aux m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Sophia Fried pour l'assistance technique. MBS remercie les organismes suivants pour leur soutien à la recherche: La Fondation Israël science des subventions no.1659/08, 971/08 1503/08 et 491/10, les ministères de la Santé et sciences de subventions aucun. 3-4114 et 3-6540, l'Association israélienne du cancer à travers la succession de feu Alexander Smidoda, et la Fondation de la famille Taubenblatt pour la bourse d'excellence Bio-médecine.
Materials
| Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Amaxa human T Cell nucleofector kit | Lonza | VCA-1002 | |
| Anti CD3 (UCHT1 clone) | BioLegend | 300432 | |
| Falcon FACS Tubes | Becton Dickinson | 352058 | |
| FCS | HyClone | SV30160.03 | |
| G418 | Calbiochem | 345810 | |
| German coverglass system 4 chamber slides | Lab-Tek II | 155382 | |
| HCl | Bio Lab | 8410501 | |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B | |
| Hygromycin | Enzo | ALX-380-306 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| PBS (10X) | Sigma | D1408 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | |
| Poly-L-lysine 0.1% (w/v) in H2O | Sigma | P8920 | |
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Equipment | |||
| Accublock digital dry bath | Labnet | D1105A | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5810 R | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 Meta | |
| Heatable mounting frame – Heating Insert P S | PeCon | 130-800-031 | |
| TempModule S (required for the heatable mounting frame) | Zeiss | 411860-9010-000 | |
| Electroporation device | Amaxa | Nucleofector I | |
| Fluorescence activated cell sorter | Becton Dickinson | FACSVantage SE | |
| Image analysis software | Bitplane | 7.0.0 |
Riferimenti
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