Analyse af opløsningsmidlet Tilgængelighed af cysteinrester på<em> Majs rayado fino virus</em> Virus-lignende partikler produceret i<em> Nicotiana benthamiana</em> Planter og tværbinding af peptider til VLP'er
Summary
En fremgangsmåde til at analysere opløsningsmidlet adgang til thiolgruppen af cysteinrester af<em> Majs rayado fino virus</em> (MRFV)-viruslignende partikler (VLP'er) efterfulgt af et peptid tværbindingsreaktion er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af tilgængeligheden af adskillige kemiske grupper på overfladen af VLP'er, der kan være mål for specifikke reaktioner.
Abstract
Efterligning og udnytte virus egenskaber og fysisk-kemiske og fysiske egenskaber besidder løfte om at levere løsninger til nogle af verdens mest presserende udfordringer. Alene rækkevidde og virustyper kombineret med deres spændende egenskaber potentielt give uendelige muligheder for ansøgninger i virus-baserede teknologier. Vira har evnen til at selv-samle til partikler med diskrete form og størrelse, specificitet symmetri, alsidighed og stabile egenskaber under et bredt område af temperatur-og pH-betingelser. Ikke overraskende med sådan en bemærkelsesværdig vifte af egenskaber, er virus foreslået til anvendelse i biomaterialer 9, vacciner 14, 15, elektroniske materialer, kemiske værktøjer og molekylær elektronisk beholdere 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
For at udnytte virus inden for nanoteknologi, skal de ændres fra deres naturlige former for at give nye funktioner. Denne udfordrende process kan udføres gennem flere mekanismer, herunder genetisk modifikation af det virale genom og kemisk fastgørelse af fremmede eller ønskede molekyler til viruspartiklen reaktive grupper 8. Evnen til at ændre en virus primært afhænger af de fysisk-kemiske og fysiske egenskaber af viruset. Desuden skal de genetiske eller fysisk-modifikationer, der skal udføres uden at påvirke den virus native struktur og virus-funktion. Majs rayado fino virus (MRFV) kappeproteiner selv samle i Escherichia coli, der producerer stabile og tomme VLP'er, der er stabiliseret med protein-protein interaktioner og som kan anvendes i virus-baserede teknologier applikationer 8. VLP'er produceret i tobaksplanter blev undersøgt som et stillads, på hvilken forskellige peptider kan være kovalent vises 13. Her beskriver vi trinene til 1) bestemme, hvilken af de opløsningsmiddel-tilgængelige cysteiner i en virus capsid fås til modifikation, og 2) Bioconjugate peptider til de modificerede capsider. Ved anvendelse af native eller mutation-indsat aminosyrerester og standard koblingsmidler teknologi, har en bred vifte af materialer er vist på overfladen af plantevirus, såsom Brome mosaikvirus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotisk skjoldet virussatellit 6, tobak mosaik virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1 og MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåden præsenteres her muliggør en meget følsom og hurtig analyse af reaktive cysteiner er til stede på overfladen af plante-produceret VLP'er samt andre protein-komplekser. Maleimider er thiol-specifikke reagenser, som reagerer med frie sulfhydrylholdige molekyler til dannelse af stabile thioetherbindinger. Denne metode bygger på specificitet maleimider til at reagere med sulfhydrylgrupper ikke er involveret i samspillet med andre aminosyrer. Bevarer den native struktur af VLP'erne er meget …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
Riferimenti
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
