L'analyse de l'accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em> Cueilleur rayado fino virus</em> Virus-like particles produits dans<em> Nicotiana benthamiana</em> Plantes et réticulation des peptides à VLP
Summary
Procédé pour analyser l'accessibilité au solvant du groupe thiol de résidus cystéine de<em> Cueilleur rayado fino virus</em> (MRFV)-particules de type virus (VLP) suivi d'un peptide réaction de réticulation est décrit. La méthode tire parti de la disponibilité de plusieurs groupes chimiques à la surface des particules de type viral qui peuvent être les cibles de réactions spécifiques.
Abstract
Imitant et l'exploitation de propriétés du virus et les caractéristiques physico-chimiques et physiques promet d'apporter des solutions à certains des défis les plus urgents de la planète. La multitude et les types de virus associés à leurs propriétés intrigantes potentiellement donner des possibilités infinies pour les applications dans les technologies à base de virus. Les virus ont la capacité de s'auto-assembler en particules de forme discrète et la taille, la spécificité de symétrie, la polyvalence, et des propriétés stables dans une large gamme de conditions de température et de pH. Sans surprise, avec une gamme remarquable de propriétés, les virus sont proposés pour être utilisés dans les biomatériaux 9, 14, 15 vaccins, du matériel électronique, des outils et des produits chimiques, l'électronique moléculaire conteneurs 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Afin d'utiliser les virus dans les nanotechnologies, elles doivent être modifiées de leurs formes naturelles pour donner de nouvelles fonctions. Ce défi processus peut être réalisée par plusieurs mécanismes comprenant la modification génétique du génome viral et la fixation chimique des molécules étrangères ou souhaitée pour les groupes réactifs des particules virales 8. La possibilité de modifier un virus dépend essentiellement des propriétés physico-chimiques et physiques du virus. En outre, les modifications génétiques ou physico-chimique doivent être effectuées sans affecter la structure du virus indigène et le fonctionnement du virus. Protéines de maïs rayado fino virus manteau (MRFV) s'auto-assembler dans Escherichia coli produisant des VLP stables et vides qui sont stabilisées par protéine-protéine interactions et qui peut être utilisé dans les applications des technologies à base de virus 8. VLP produites dans des plants de tabac ont été examinés comme un échafaudage sur lequel une variété de peptides peuvent être affichés de manière covalente 13. Ici, nous décrivons les étapes 1) à déterminer lequel des cystéines accessibles au solvant dans une capside du virus sont disponibles pour les modification, et 2) Bioconjugate peptides modifiés pour les capsides. En utilisant indigènes ou par mutation-inséré résidus d'acides aminés et des standards des technologies de couplage, une grande variété de matériaux ont été affichées sur la surface des virus de plantes tels que le virus de la mosaïque de Brome 3, virus de la panachure Carnation 12, niébé virus de la marbrure chlorotique 6, la mosaïque du tabac virus 17, virus de la mosaïque jaune navet 1, et MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici permet une analyse très sensible et rapide de cystéines réactives présentes sur la surface de particules de type viral de plantes produites ainsi que tous les autres complexes protéiques. Maléimides sont thiol-spécifique des réactifs, qui réagissent avec sulfhydryle libres des molécules contenant de former des liaisons thioéther stable. Cette méthode s'appuie sur la spécificité des maléimides à réagir avec des groupes sulfhydryle pas impliqués dans les interactions avec …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
Riferimenti
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