Un metodo per analizzare l'accessibilità al solvente del gruppo tiolo della cisteina residui di Mais Rayado Fino virus (MRFV)-particelle simili a virus (VLPs) seguiti da un peptide reazione di reticolazione è descritto. Il metodo sfrutta la disponibilità di gruppi chimici diversi sulla superficie delle VLPs che possono essere bersagli per reazioni specifiche.
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Articolo metodologico
Analisi della accessibilità al solvente dei residui di cisteina in
In questo articolo
Sommario
Abstract
Imitare e sfruttando le proprietà e le caratteristiche fisico-chimiche dei virus e fisico promette di fornire soluzioni ad alcune delle sfide più pressanti del mondo. La gamma pura e tipi di virus insieme con le loro proprietà potenzialmente intriganti dare infinite opportunità per le applicazioni in tecnologie basate su virus. Virus hanno la capacità di auto-assemblano in particelle di forma e dimensioni discrete, specificità di simmetria, polivalenza e proprietà stabili in un'ampia gamma di condizioni di temperatura e di pH. Non sorprendentemente, con una notevole gamma di proprietà, i virus sono proposti per l'uso in vaccini biomateriali 9, 14, 15, materiali elettronici, strumenti chimici e molecolare elettronica contenitori 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Al fine di utilizzare i virus in nanotecnologie, devono essere modificati dalle loro forme naturali per impartire nuove funzioni. Questo impegnativo process può essere effettuato attraverso meccanismi diversi tra modificazione genetica del genoma virale e attaccare chimicamente molecole estranee o desiderato per i gruppi reattivi delle particelle virali 8. La possibilità di modificare un virus dipende principalmente dalle proprietà fisico-chimiche e fisiche del virus. Inoltre, le modifiche genetiche o fisico-chimiche devono essere eseguite senza alterare la struttura originaria del virus e la funzione virus. Mais Rayado Fino virus (MRFV) proteine di rivestimento auto-assemblano in Escherichia coli che producono VLP stabili e vuoti che sono stabilizzati da proteina-proteina interazioni e che possono essere utilizzati in applicazioni basate su virus tecnologie 8. VLPs prodotte in piante di tabacco sono stati esaminati da impalcatura su cui una varietà di peptidi possono essere covalentemente visualizzato 13. Qui, descriviamo la procedura per 1) determinare quale dei solventi accessibili cisteine in un capside del virus sono disponibili per modifizione, e 2) Bioconjugate peptidi alle capsidi modificati. Utilizzando nativi o mutationally-inserito residui di aminoacidi e tecnologie standard di accoppiamento, una grande varietà di materiali sono stati visualizzati sulla superficie del virus vegetali come, virus del mosaico Brome 3, virus della screziatura Carnation 12, Cowpea clorotiche mottle virus 6, mosaico del tabacco virus 17, Rapa virus del mosaico giallo 1, e MRFV 13.
Protocollo
1. Virus Inoculazione e purificazione VLP da piante di Nicotiana benthamiana
- Produrre ricoperti T7-RNA trascritti da Virus X della patata (PVX) basati su plasmidi vettori che trasportano MRFV wild-type (WT) e proteina di rivestimento Cys-mutato (CP) geni 12, utilizzando Ambion il T7-mMessage mmachine kit.
- Per ogni reazione di trascrizione T7, inoculare due foglie completamente espanse di N. benthamiana con 10 reazioni e incubare le piante per 10 giorni in serra, al 60% di umidità per 16 ore di luce (25.000-30.000 lux) a 25 ° C e 8 ore buio a 20 ° C.
- Harves t N. benthamiana infettat....
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Risultati
Espressione transitoria di cappotto mutanti MRFV proteine (CP) geni in N. benthamiana piante in un PVX basati VLPs vettore producono è descritto nella Figura 1. Il mantello modificato MRFV proteina gene viene amplificato mediante PCR e quindi posto sotto il controllo trascrizionale del promotore subgenomico duplicato CP in un PVX-based vettore, pP2C2S 2, (un dono di D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Inghilterra). In vitro la trascrizione di RNA produce trascri.......
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Discussione
Il metodo qui presentato permette una analisi molto sensibile e rapido delle cisteine reattive presenti sulla superficie delle piante prodotte VLPs nonché su complessi di proteine. Maleimmidi sono tiolo-specifici reagenti, che reagiscono con liberi sulfidrilici contenenti molecole di formare legami stabili tioetere. Questo metodo disegna sulla specificità delle maleimmidi di reagire con i gruppi sulfidrilici non coinvolti in interazioni con altri aminoacidi. Mantenendo la struttura nativa delle VLPs è molto importante.......
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Dichiarazioni
Menzione dei nomi commerciali dei prodotti commerciali nella pubblicazione è al solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubi | Beckman | 344059 | |
| mMessage mmachine T7 Kit | Vita Tecnologie | AM1344M | |
| Fluoresceina-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 non è sostituto ordine con F150 |
| Pierce Biotina quantificazione Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-biotina, No-Pesare Formato | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM (PEG) n Reticolanti | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-glicina gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris glicina SDS tampone di corsa | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris glicina Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulosa membrana del filtro di carta Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Fosfatasi affinità etichetta Purificato Anticorpi anti-IgG di coniglio | Kirkegaard e Laboratori Perry | 0751516 | |
| NBT / BCIP Fosfatasi substrato | Kirkegaard e Laboratori Perry | 508107 |
Riferimenti
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2
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Ristampe e permessi
