El análisis de la accesibilidad al disolvente de los residuos de cisteína en<em> Maize rayado fino virus</em> Partículas similares al virus producidas en<em> Nicotiana benthamiana</em> Plantas y reticulación de péptidos a VLPs
Summary
Un método para analizar la accesibilidad al disolvente del grupo tiol de residuos de cisteína de<em> Maize rayado fino virus</em> (MRFV)-partículas similares a virus (VLPs), seguido por un péptido reacción de reticulación se describe. El método tiene la ventaja de la disponibilidad de varios grupos químicos en la superficie de las VLP que pueden ser dianas para reacciones específicas.
Abstract
Imitando y explotar las propiedades del virus y las características físico-químicas y físicas es una promesa de aportar soluciones a algunos de los desafíos más apremiantes del mundo. La enorme gama y los tipos de virus, junto con sus propiedades intrigantes potencialmente dar un sinfín de oportunidades para las aplicaciones en las tecnologías basadas en el virus. Los virus tienen la capacidad de auto-ensamblarse en partículas con forma discreta y tamaño, la especificidad de la simetría, la polivalencia, y propiedades estables bajo un amplio rango de condiciones de temperatura y pH. No es sorprendente que, con una gama tan notable de las propiedades, los virus se proponen para uso en biomateriales 9, las vacunas 14, 15, materiales electrónicos, herramientas, químicos y electrónicos molecular contenedores 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
A fin de utilizar los virus en la nanotecnología, deben ser modificados a partir de sus formas naturales para impartir nuevas funciones. Este desafiante proceso se puede realizar a través de varios mecanismos incluyendo la modificación genética del genoma viral y químicamente unir moléculas extrañas o deseada a los grupos reactivos de partículas de virus 8. La capacidad de modificar un virus depende principalmente de las propiedades físico-químicas y físicas del virus. Además, las modificaciones genéticas o físico-químico necesario llevar a cabo sin afectar negativamente a la estructura del virus nativo y la función virus. Rayado fino del maíz de virus (MRFV) proteínas de la capa auto-ensamblan en Escherichia coli productoras de VLPs estables y vacío que están estabilizadas por proteína-proteína y las interacciones que se pueden utilizar en aplicaciones basados en virus tecnologías 8. VLPs producidas en plantas de tabaco se examinaron como un andamio sobre el que puede ser una variedad de péptidos covalentemente muestra 13. Aquí, se describen los pasos para 1) determinar cuál de las cisteínas accesible al disolvente en una cápside de virus están disponibles para la modificacióncatiónico, y 2) Bioconjugate péptidos a las cápsidas modificadas. Mediante el uso de los residuos de aminoácidos nativos o mutacionalmente inserta-ácidos y las tecnologías estándar de acoplamiento, una amplia variedad de materiales han sido presentados en la superficie de virus de plantas tales como, virus del mosaico del bromo 3, virus del moteado del clavel 12, caupí virus del moteado clorótico 6, del mosaico del tabaco 17 virus, virus mosaico amarillo del nabo 1, y MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado aquí permite un análisis muy sensible y rápida de cisteínas reactivas presentes en la superficie de VLPs producidos por plantas así como en otros complejos de proteínas. Las maleimidas son tiol reactivos específicos, que reaccionan con sulfhidrilo libres que contienen moléculas para formar enlaces tioéter estables. Este método se basa en la especificidad de las maleimidas para reaccionar con grupos sulfhidrilo que no participan en las interacciones con otros aminoácidos. Preservar la est…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
Riferimenti
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