Triagem para Modificadores Melanoma usando um modelo de tumor Zebrafish autóctone
Summary
Uma forma rápida de tela para modificadores de melanoma, utilizando um modelo de tumor zebrafish autóctone é apresentado. Leva vantagem de o vector miniCoopR que permite a expressão de genes candidatos de melanoma nos melanócitos. Um método para obtenção das curvas de sobrevida livre de melanoma, um ensaio de invasão, um protocolo para a coloração de anticorpos de melanócitos de escala e um ensaio de transplante de melanoma são descritos.
Abstract
Estudos genômicos de cânceres humanos produziram uma riqueza de informações sobre os genes que são alterados em tumores 1,2,3. Um desafio proveniente destes estudos é que muitos genes é alterada, e isso pode ser difícil distinguir as alterações genéticas que levaram tumorigénese de que aqueles surgiu incidentalmente durante a transformação. Para fazer esta distinção é benéfico ter um ensaio que pode medir quantitativamente o efeito de um gene alterado em iniciação do tumor e de outros processos que permitem que os tumores de persistir e disseminar. Apresentamos aqui um meio rápido para pesquisar um grande número de modificadores candidatos de melanoma no peixe-zebra utilizando um modelo de 4 autóctone tumor que inclui os passos necessários para a iniciação e manutenção de melanoma. Um reagente chave no presente ensaio é o vector miniCoopR, que acopla a cópia de tipo selvagem do factor especificação mitfa melanócito para uma cassete na qual a recombinação gateway candidato melAnoma genes podem ser recombinados 5. O vector tem um minigene miniCoopR resgate mitfa que contém o promotor, quadros de leitura aberta e região 3 'não traduzida do gene de tipo selvagem mitfa. Ele permite fazer construções de comprimento total, utilizando quadros de leitura abertos de modificadores de melanoma candidatos. Estes clones individuais podem então ser injetado em uma única célula de Tg (mitfa: BRAF V600E), p53 (lf); embriões mitfa (LF) zebrafish. O vector miniCoopR fica integrado por Tol2 mediada por transgénese 6 e resgates melanócitos. Porque eles são fisicamente acoplados ao resgate mitfa minigene, genes candidatos são expressos em melanócitos resgatados, alguns dos quais irão transformar e desenvolver-se em tumores. O efeito de um gene candidato para a iniciação melanoma e as propriedades das células de melanoma pode ser medida utilizando as curvas de sobrevida livre de melanoma, ensaios de invasão, coloração de anticorpos e ensaios de transplante.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método miniCoopR permite a expressão de genes de interesse em melanócitos zebrafish. Esta abordagem toma vantagem do facto de que o gene do peixe-zebra mitfa age células autonomamente. Por este motivo, os melanócitos resgatados pelo vector miniCoopR são determinados para conter o minigene e qualquer gene de interesse ao qual ele está fisicamente acoplados. Melanócitos resgatados são claramente visíveis e podem ser obtidos de animais que foram injectados como embriões de uma única célula. Um grau …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Leonard I. Zon em cujo laboratório estas técnicas foram desenvolvidas inicialmente; Kristen Kwan eo falecido Chi-Bin Chien para presentes de plasmídeos utilizados neste trabalho, Tiago e David Lister Raible para assistência com coloração de anticorpos e James Neiswender para o vídeo microinjecção. Este trabalho foi financiado pelo NIH concessão R00AR056899-03 para CJC
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Riferimenti
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