संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस और 3 डी संरक्षित अंतरावस्था नाभिक पर डीएनए मछली 3D परमाणु संगठन में परिवर्तन का अध्ययन
Summary
यहाँ हम डीएनए मछली द्वारा immunofluorescence और डीएनए दृश्यों 3 डी माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण (3 डी मछली इम्युनो डीएनए) द्वारा पीछा द्वारा histone संशोधनों के साथ – साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
स्वस्थानी तीन dimensionally संरक्षित 3 डी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा नाभिक पर डीएनए जांच का उपयोग संकरण में प्रतिदीप्त (3 डी डीएनए मछली) सबसे सीधा जीन loci के स्थान, उप क्षेत्रों गुणसूत्र या व्यक्ति की कोशिकाओं में पूरे प्रदेशों कल्पना का प्रतिनिधित्व करता है. विश्लेषण के इस प्रकार के नाभिक की वैश्विक वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट जीनोमिक loci और क्षेत्रों परमाणु अंतरिक्ष के भीतर के व्यवहार में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. इम्यूनोफ्लोरेसेंस, दूसरे हाथ पर, परमाणु प्रोटीन (संशोधित histones, histone वेरिएंट और संशोधक, प्रतिलेखन मशीनरी और कारकों, परमाणु उप डिब्बों, आदि) का पता लगाने की अनुमति देता है. immunofluorescence और 3 डी डीएनए में मछली के संयोजन में प्रमुख चुनौती एक एंटीबॉडी द्वारा नाभिक के 3 डी वास्तुकला के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पता लगाया मिलान रक्षा हाथ पर है, और दूसरे हाथ पर, का पता लगाने के लिए डीएनए जांच की पहुंच की अनुमति जीन loci या गुणसूत्र प्रदेशों 1-5. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल कि 3 डी संरक्षित नाभिक में जीनोमिक loci के साथ chromatin संशोधनों के दृश्य को जोड़ती है प्रदान करते हैं.
Introduction
Epigenetic तंत्र ट्रिगर स्थापना और विकास और सेल प्रकार विशिष्ट transcriptional प्रोफाइल की विरासत है. एक स्तर पर इस chromatin पैकेजिंग है कि सक्रिय या चुप जीनोमिक क्षेत्रों को परिभाषित मॉडुलन शामिल है. एक बड़े पैमाने पर, जीनोम और परमाणु वास्तुकला की वैश्विक 3D संगठन भी transcriptional पैटर्न के नियंत्रण में एक भूमिका निभाते हैं. इस प्रकार, इन epigenomic सुविधाओं का विच्छेदन कैसे जीन 6-11 विनियमित रहे हैं की एक पूरी समझ के लिए आवश्यक है.
संयुक्त immunofluorescence और 3 डी डीएनए मछली एक अद्वितीय विशिष्ट बातचीत / डीएनए दृश्यों और / या प्रोटीन नाभिक के भीतर के संघों का आकलन करके आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण के पूरक का अवसर प्रदान करते हैं. इसके अलावा, जबकि जीनोम चौड़ा chromatin immunoprecipitation (चिप seq) या गुणसूत्र पर कब्जा गहरी अनुक्रमण के साथ मिलकर रचना के रूप में इस तरह के उच्च throughput तकनीक (4C seq, 5C, हाय – सी) वैश्विक dat प्रदानसेल 12 आबादी पर एक, इम्यूनोफ्लोरेसेंस डीएनए / मछली तकनीक एकल कोशिका के स्तर पर विश्लेषण सक्षम.
यहाँ हम डीएनए मछली द्वारा immunofluorescence और डीएनए दृश्यों 3 डी माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण (3D इम्युनो मछली) द्वारा पीछा द्वारा histone संशोधनों के साथ – साथ पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल का लाभ डीएनए और प्रोटीन संरचनाओं के संरक्षण के संयुक्त दृश्य है. इस क्षेत्र में हमारा अनुभव हमें सक्षम है सुधार करने के लिए और मौजूदा प्रोटोकॉल को सरल. हालांकि हम इस प्रोटोकॉल पुनर्संयोजन के दौर से गुजर लिम्फोसाइटों में डीएनए डबल असहाय टूट का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया है, इस विधि अन्य प्रोटीन और अन्य सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊपर विस्तृत तकनीक हमारी प्रयोगशाला में वी (डी) और लिम्फोसाइटों 30,31 विकास में इम्यूनोग्लोबिन Tcra / घ loci जम्मू पुनर्संयोजन के विनियमन का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. हमें विश्वास है कि इस त…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चर्चाओं और टिप्पणियों के लिए Skok प्रयोगशाला, विशेष रूप से Susannah हेविट, के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) द्वारा समर्थित है. JAS एक लेकिमिया और लिंफोमा सोसायटी विद्वान है. जे.सी. कैंसर अनुसंधान संस्थान के एक Irvington संस्थान फैलो है. एम.एम. एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान एकीकृत स्नातकोत्तर शिक्षा तथा अनुसंधान Traineeship (NSF IGERT 0333389) द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
Riferimenti
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