Cryosectioning Gær Fællesskaber for Undersøgelse Fluorescens Patterns
Summary
Vi præsenterer en protokol til frysning og cryosectioning gær samfund til at observere interne mønstre af fluorescerende celler. Metoden bygger på methanol-fixing og OLT-indlejring for at bevare den rumlige fordeling af celler uden at inaktivere fluorescerende proteiner inden for et fællesskab.
Abstract
Mikrober bor typisk i fællesskaber. Den rumlige organisation af celler i et samfund menes at påvirke overlevelse og funktion i samfundet 1. Optiske sektionering teknikker, herunder konfokal og to-foton mikroskopi, har vist sig nyttig til at observere rumlig organisering af bakterie-og archaeal fællesskaber 2,3. En kombination af konfokal billeddannelse og fysisk inddeling af gærkolonier har afsløret interne organisation af celler 4. Imidlertid har direkte optisk sektionering med konfokal eller to-foton mikroskopi kun været i stand til at nå et par cellelag dybt ind gærkolonier. Denne begrænsning er sandsynligvis på grund af stærk lysspredning fra gærceller 4.
Her præsenteres en metode baseret på fastsættelse og cryosectioning at opnå rumlige fordeling af fluorescerende celler i Saccharomyces cerevisiae samfund. Vi anvender methanol som fikseringsmiddel middelat bevare den rumlige fordeling af cellerne. Faste samfund er infiltreret med OCT-forbindelse, frosset og cryosectioned i en kryostat. Fluorescensimagografi af sektionerne afslører den interne organisation af fluorescerende celler i samfundet.
Eksempler på gær samfund bestående af stammer, der udtrykker røde og grønne fluorescerende proteiner viser potentialet ved cryosectioning fremgangsmåde til at afsløre den rumlige fordeling af fluorescerende celler og den for genekspression i gærkolonier 2,3. Selvom vores fokus har været på Saccharomyces cerevisiae samfund, kan den samme metode potentielt kan anvendes til at undersøge andre mikrobielle samfund.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den procedure, der præsenteres her giver en måde at inspicere den interne struktur i gær samfund. The methanol fastsættelse trin gør gær koloni stift 8 og bevarer integriteten af kolonien, men det medfører også krympning 8, der bør tages i betragtning ved fortolkningen af resultaterne. Vi typisk ser omkring 30% krympning i højden af gærkolonier, sammenlignet med kolonier direkte indlejret i OLT uden fastsættelse af 9.
For at undgå svind, en alter…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Jonathan Cooper Lab på Fred Hutchinson Cancer Research Center for tilladelse til at bruge deres kryostat. Dette arbejde blev støttet af NIH og WM Keck Foundation. BM er en Gordon og Betty Moore stipendiat of Life Science Research Foundation. Vi er taknemmelige for Daniel Gottschling for at dele sine fastsættelse protokol med os.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
Riferimenti
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetica. 184 (3), 707-716 (2010).
