Criosezionamento Comunità di lievito per l'esame di pattern di fluorescenza

Summary

Vi presentiamo un protocollo per congelare e criosezionamento comunità di lievito per osservare i modelli interni di cellule fluorescenti. Il metodo si basa su di fissaggio e metanolo-OCT-incorporamento per preservare la distribuzione spaziale di celle senza inattivare proteine ​​fluorescenti all'interno di una comunità.

Abstract

I microbi in genere vivono in comunità. L'organizzazione spaziale delle cellule all'interno di una comunità si crede di influenzare la sopravvivenza e la funzione della comunità ^1. Tecniche ottiche di sezionamento, tra cui la microscopia confocale e due fotoni, si sono dimostrati utili per osservare l'organizzazione spaziale delle comunità batteriche e archaeal ^2,3. Una combinazione di imaging confocale e sezionamento fisico di colonie di lievito ha rivelato organizzazione interna delle cellule ^4. Tuttavia, diretto sezionamento ottico usando la microscopia confocale a due fotoni o è stato solo in grado di raggiungere un paio di strati di cellule in profondità in colonie di lievito. Questa limitazione è probabilmente a causa della dispersione di luce intensa da cellule di lievito ^4.

Qui vi presentiamo un metodo basato sulla determinazione e criosezionamento per ottenere la distribuzione spaziale delle cellule fluorescenti all'interno delle comunità di Saccharomyces cerevisiae. Usiamo metanolo come agente fissativoda mantenere la distribuzione spaziale delle cellule. Comunità fissi sono infiltrati con OCT, congelati, e cryosectioned in un criostato. Imaging di fluorescenza delle sezioni rivela come l'organizzazione interna delle cellule fluorescenti all'interno della comunità.

Esempi di comunità costituite ceppi di lievito che esprimono proteine ​​fluorescenti rosse e verdi dimostrare le potenzialità del metodo criosezionamento per rivelare la distribuzione spaziale delle cellule fluorescenti così come quella di espressione genica all'interno colonie di lievito ^2,3. Anche se la nostra attenzione si è concentrata sulle comunità di Saccharomyces cerevisiae, lo stesso metodo può potenzialmente essere applicato a esaminare altre comunità microbiche.

Protocol

1. Fissaggio Comunità lievito Crescono comunità lievito su un filtro a membrana (ad esempio, Millipore MF membrana filtrante; Figura 2A). Questo protocollo corrisponde ad una tipica comunità inferiore a 2×10 8 celle di un millimetro di diametro 6 filtro a membrana. Utilizzare un pezzo di carta da filtro Whatman 541 per coprire il fondo di un diametro di 1 cm-ben (Figura 2B). Questa carta Whatman sarà utilizzato come vettore per trasferire la …

Representative Results

Immagini di fluorescenza di sezioni verticali delle comunità lievito contenenti rosso o verde etichettato popolazioni competitivi 6 sono mostrati nella Figura 3. Queste comunità sono costituiti da due ceppi di lievito e prototrofici loro competizione per risorse condivise, incluso lo spazio, porta a colonnare modelli 7, come mostrato nelle sezioni verticali. Risoluzioni fino a una singola cellula può essere risolto in sezioni. Figura 3 confronta sezioni delle co…

Discussion

La procedura qui presentata offre un modo per controllare la struttura interna delle comunità lievito. La fase di fissaggio metanolo rende la colonia di lievito rigido ⁸ e preserva l'integrità della colonia, tuttavia, causa anche restringimento ⁸ che deve essere preso in considerazione nell'interpretazione dei risultati. Noi di solito vedere circa il 30% in altezza ritiro delle colonie di lievito, rispetto alle colonie direttamente incorporati nei PTOM senza fissare ^9.

<p c…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
100% Methanol	J.T. Baker	9070-01
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Andwin Scientific	4583
Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper	Whatman	1541-047
Millipore-MF Membrane Filter	Millipore	HAWP04700
Cryostat	Leica	CM 1510 S