Cryosectioning comunidades de leveduras para o exame de padrões de fluorescência
Summary
Nós apresentamos um protocolo para congelamento e cryosectioning comunidades de leveduras para observar padrões internos de células fluorescentes. O método baseia-se na fixação de metanol e OCT-incorporação de preservar a distribuição espacial das células sem inactivar proteínas fluorescentes dentro de uma comunidade.
Abstract
Micróbios geralmente vivem em comunidades. A organização espacial das células dentro de uma comunidade é acreditado para impactar a sobrevivência e função da comunidade 1. Ópticos técnicas de seccionamento, incluindo microscopia confocal e de dois fótons, têm se mostrado útil para observar a organização espacial das comunidades de bactérias e archaea 2,3. Uma combinação de imagem confocal e seccionamento física de colónias de levedura revelou a organização interna de celas 4. No entanto, seccionamento óptico direto em microscópio confocal ou dois fótons foi apenas capaz de atingir algumas camadas de células profundas em colônias de leveduras. Esta limitação é provavelmente devido à dispersão de luz forte a partir de células de levedura 4.
Aqui, apresentamos um método baseado na fixação e cryosectioning para obter uma distribuição espacial de células fluorescentes dentro de comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fixadorpara preservar a distribuição espacial das células. Comunidades fixos são infiltradas com OCT composto, congelados, e cryosectioned num criostato. Imagens de fluorescência das seções revela que a organização interna das células fluorescentes dentro da comunidade.
Exemplos de comunidades de leveduras consistindo em estirpes que expressam as proteínas de vermelho e verde fluorescente demonstrar as potencialidades do método cryosectioning para revelar a distribuição espacial de células fluorescentes, bem como a expressão de genes dentro de colónias de levedura 2,3. Mesmo que o foco tem sido sobre as comunidades de Saccharomyces cerevisiae, o mesmo método pode ser potencialmente aplicada a examinar outras comunidades microbianas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O procedimento aqui apresentado oferece um modo para inspeccionar a estrutura interna das comunidades de leveduras. O passo de fixação faz com que o metanol colónia de levedura rígida 8 e preserva a integridade da colónia, no entanto, também provoca 8 encolhimento que devem ser tidos em conta na interpretação dos resultados. Se costuma ver em torno de 30% de encolhimento da altura de colônias de leveduras, em comparação com as colônias diretamente embutidos em outubro sem fixar 9.<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Jonathan Cooper Lab no Fred Hutchinson Cancer Research Center for a permissão para usar seu criostato. Este trabalho foi financiado pelo NIH e do WM Keck Foundation. BM é um Gordon e Betty Moore companheiro de Vida Fundação de Pesquisa Científica. Somos gratos a Daniel Gottschling para compartilhar seu protocolo de fixação com a gente.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
| Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
| Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
| Cryostat | Leica | CM 1510 S |
Riferimenti
- Tolker-Nielsen, T., Molin, S. Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities. Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).
- Moller, S., et al. In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members. Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).
- Lepp, P. W., et al. Methanogenic Archaea and human periodontal disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).
- Váchová, L., et al. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).
- Mináriková, L., et al. Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies. Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).
- Shou, W., et al. Synthetic cooperation in engineered yeast populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).
- Momeni, B., et al. Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities. , (2012).
- Kiernan, J., ed, . Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice. , 4 (2008).
- Piccirillo, S., et al. The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies. Genetica. 184 (3), 707-716 (2010).
