Biz floresan hücrelerin iç kalıplarını gözlemlemek maya topluluklar donma ve cryosectioning için bir protokol mevcut. Yöntem metanol-sabitleme dayalıdır ve bir topluluk içinde floresan proteinleri inaktive olmadan hücrelerinin mekansal dağılımını korumak için OCT-katıştırma.
Mikroplar genellikle topluluklar yaşıyor. Bir topluluk içinde hücrelerin mekansal organizasyon topluluğu 1 hayatta kalma ve fonksiyon etkisi olduğuna inanılmaktadır. Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Optik kesit teknikleri, bakteri ve arke topluluklarının 2,3 mekansal organizasyon gözlemlemek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Konfokal görüntüleme ve maya kolonileri fiziksel kesit kombinasyonu hücreleri 4 iç organizasyonu ortaya koymuştur. Ancak, konfokal veya iki foton mikroskopi kullanılarak doğrudan optik kesit maya kolonileri içine derin bir kaç hücre tabakaları ulaşmak için sadece mümkün olmuştur. Bu sınırlama nedeniyle maya hücreleri 4 ışık güçlü saçılma muhtemeldir.
Burada, sabitleme ve Saccharomyces cerevisiae topluluklar içinde floresan hücrelerin mekansal dağılımını elde etmek için cryosectioning dayalı bir yöntem sunuyoruz. Biz sabitleştirici ajan olarak metanol kullanımıhücrelerinin mekansal dağılımını korumak. Sabit topluluklar Kriyostaz OCT bileşiği, dondurulmuş ve cryosectioned ile infiltre edilir. Bölümlerin Floresans görüntüleme toplum içinde floresan hücrelerin iç organizasyonunu ortaya koymaktadır.
Kırmızı ve yeşil floresan protein eksprese eden maya suşu oluşan toplulukların örnekleri de mantar kolonileri 2.3 içinde gen ekspresyonunun bu gibi floresan hücrelerinin uzaysal dağılımının ortaya çıkarmak için cryosectioning yöntem potansiyellerini göstermek. Bizim odak Saccharomyces cerevisiae topluluklar olmuştur rağmen, aynı yöntem potansiyel olarak diğer mikrobiyal topluluklar incelemek için uygulanabilir.
Burada sunulan prosedür maya toplulukların iç yapısını incelemek için bir yol sunar. Metanol sabitleme adım 8 maya kolonisi sertleştirir ve koloninin bütünlüğünü korur, ancak aynı zamanda sonuçların yorumlanmasında dikkate alınması gerektiğini büzülme 8 neden olur. Biz genellikle, doğrudan 9 düzeltmeden OCT gömülü koloniler göre maya kolonilerinin yüksekliği yaklaşık% 30 daralma, bkz.
Çekmeyi önlemek için, cryosectioning i…
The authors have nothing to disclose.
Biz onların kriyostat kullanma izni için Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi'nde Jonathan Cooper Lab teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH ve WM Keck Vakfı tarafından desteklenmiştir. BM Yaşam Bilim Araştırma Vakfı, Gordon ve Betty Moore akademisyendir. Biz bize yaptığı tespit protokolü paylaşmak için Daniel Gottschling minnettarız.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
100% Methanol | J.T. Baker | 9070-01 | |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Andwin Scientific | 4583 | |
Whatman Grade No. 541 Quantitative Filter Paper | Whatman | 1541-047 | |
Millipore-MF Membrane Filter | Millipore | HAWP04700 | |
Cryostat | Leica | CM 1510 S |