טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים
Summary
פרוטוקול חדש להכנה מכאנית של השעיות אשכים סלולריים מחומר מכרסם, הימנעות אנזימים וחומרי ניקוי, מתואר. השיטה היא מאוד פשוטה, מהירה, לשחזור, והופכת השעיות תא באיכות טובות, אשר מתאימות למיון זרימה ומיצוי RNA.
Abstract
אשכים יונקים הם איברים מורכבים מאוד המכילים יותר מ -30 סוגי תאים שונים, כוללים תאים הסומטיים אשכים ושלבים של תאי germline שונים. ההטרוגניות הזאת היא חסרון מהותי הנוגע למחקר מהבסיסים של spermatogenesis יונקים, כפי שאוכלוסיות תאים טהורות או מועשרת בשלבים מסוימים של התפתחות זרע יש צורך ברוב הניתוחים מולקולריים 1.
אסטרטגיות שונות כגון 2,3 Staput, elutriation צנטריפוגלי 1, וcytometry הזרימה (FC) 4,5 להיות מועסקת להשיג אוכלוסיות תאי אשכים מועשרים או מטוהרים על מנת לאפשר ביטוי במחקרי גן דיפרנציאלי.
נדרש כי תאים בתרחיף עבור רוב ההעשרה / טיהור גישות. באופן אידיאלי, את ההשעיה התא תהיה נציג של הרקמה המקורית, יש שיעור גבוה של תאי קיימא וכמה multinucleates – שנוטים להיווצר בגללטבע סינסיציאלי של האפיתל seminiferous 6,7 – וגושי תאי חוסר 1. דיווחים קודמים שמעידים כי השעיות תא אשכים שהוכנו על ידי שיטה מכאנית באופן בלעדי בכבדות בקלות רבה יותר מאשר אלה trypsinized 1. מצד השני, טיפולים אנזימטיים עם RNases ו / או אנזימי ריסוק כמו טריפסין וcollagenase להוביל לפירוק מולקולות ספציפי, אשר אינו רצוי עבור יישומים במורד הזרם מסוימים. התהליך האידיאלי צריך להיות קצר ככל האפשר, וכרוך במניפולציה מינימאלית, כדי להשיג שימור טוב של מולקולות של עניין, כגון mRNAs. פרוטוקולים הנוכחיים להכנת תאים מרקמות מוצקות מתלים הם בדרך כלל זמן רב, מאוד תלויים במפעיל, ועלולים לפגוע באופן סלקטיבי תאים מסוגים מסוימים 1,8.
הפרוטוקול המובא כאן משלב את היתרונות של disaggregation מכאני לשעתקו מאוד וקצר מאוד עםbsence האנזימטית של טיפול, מה שמוביל להשעיות תא באיכות טובות, שניתן להשתמש בם לניתוח תזרים cytometric ומיון 4, ומחקרי ביטוי גנים נסתרים 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה האופטימלית המתוארת כאן מאפשרת הכנה של השעיות תא מרקמת אשך מכרסם בדרך מהירה ולשעתק מאוד, הימנעות מטיפול אנזים וחומר ניקוי ושמירה על שלמות תא טובה ופרופורציות סוג. קיצורו של הנוהל (תוחלת 15 דקות כוללת נתיחת אשך, חיתוך רקמות, ועיבוד), הטיפול מינימאלי המעורבים, והיעד…
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי CSIC (אני + D פרויקט C022) וPEDECIBA. המחברים מבקשים להודות לMariela Bollati ולנטינה Porro מיחידת הביולוגיה של התא (המכון פסטר דה מונטבידאו) לשיתוף הפעולה הנדיב שלהם בנוגע לסדרן תא MoFlo, וMerial-מונטווידאו לעדינות מספק את כל הדגימות שרקנו המשמשות בפרויקט זה. איור 1 שוחזר באישור ביומד המרכזי; איורים 2 ו -3, ולוח 1 באישורו של ס 'Karger AG, באזל, ואיורים 4 ו -5 היו לשכפל או מותאמים באישור של John Wiley & Sons, Inc (זכויות יוצרים שבבעלות Wiley- בלקוול, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
Riferimenti
- Meistrich, M. L., Prescott, D. M. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
