Enkel og effektiv teknikk for utarbeidelse av testikkel cellesuspensjoner
Summary
En roman protokoll for den mekaniske utarbeidelse av testiklene cellesuspensjoner fra gnager materialet, unngå enzymer og vaskemidler, er beskrevet. Metoden er svært enkel, rask, reproduserbar, og gjengir god kvalitet cellesuspensjoner, som er egnet for flow sortering og RNA ekstraksjon.
Abstract
Pattedyr testiklene er svært komplekse organer som inneholder over 30 forskjellige celletyper, inkludert somatiske testikkelceller og ulike stadier av kimlinje celler. Denne heterogenitet er en viktig ulempe når det gjelder studium av basene av spermatogenesen hos pattedyr, som rene eller anrikede cellepopulasjoner i visse stadier av utvikling av spermiene er nødvendig for de fleste molekylære analyser 1.
Forskjellige strategier som 2,3 Staput, sentrifugal elutriation 1, og strømningscytometri (FC) 4,5 er anvendt for å oppnå anriket eller renset testikulære cellepopulasjoner for å muliggjøre differensiell genekspresjon studier.
Det kreves at cellene er i suspensjon i de fleste berikelse / rensing tilnærminger. Ideelt sett vil cellesuspensjonen være representative for den opprinnelige vev, har en høy andel av levedyktige celler og noen multinucleates – som har en tendens til å danne grunn avsyncytiale natur seminiferous epitel 6,7 – og mangel celle klumper en. Tidligere rapporter hadde dokumentert at testiklene cellesuspensjoner utarbeidet av en utelukkende mekanisk metode klumpet seg lettere enn trypsinisert seg en. På den annen side, enzymatiske behandlinger med RNases og / eller disaggregating enzymer som trypsin og kollagenase fører til spesifikke makromolekyler degradering, noe som er uønsket for visse anvendelser nedstrøms. Den ideelle prosess skal være så kort som mulig, og involvere minimal manipulering, slik at man oppnår en god bevaring av makromolekyler av interesse, slik som mRNA. Nåværende protokoller for utarbeidelse av cellesuspensjoner fra solide vev er vanligvis tidkrevende, svært avhengig av operatør, og kan selektivt skade visse celletyper 1,8.
Protokollen som presenteres her kombinerer fordelene med en meget reproduserbar og ekstremt kort mekanisk disaggregation med enbsence for enzymatisk behandling, som fører til god kvalitet cellesuspensjoner som kan brukes for flowcytometrisk analyse og sortering 4, og utenforliggende genekspresjon studier 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den optimaliserte metoden beskrevet her gjør utarbeidelse av cellesuspensjoner fra gnager testikkelvev i en svært rask og reproduserbar måte, unngå enzym og vaskemiddel behandling og opprettholde god celle integritet og skriver proporsjoner. Den korte prosedyren (15 min span inkluderer testis disseksjon, vevsskjæring, og behandling), minimal håndtering involvert, og fravær av enzymatiske behandlinger er noen av de viktigste fordelene. Alle disse ville forklare den gode konservering av kort levetid makromolekyler,…
Acknowledgements
Dette arbeidet ble delvis støttet av CSIC (I + D prosjekt C022) og PEDECIBA. Forfatterne ønsker å takke Mariela Bollati og Valentina Porro fra Cell Biology Unit (Institut Pasteur de Montevideo) for deres generøse samarbeid om MoFlo celle sorter, og Merial-Montevideo for forsiktig gi alle marsvin prøver som brukes i dette prosjektet. Figur 1 ble gjengitt med tillatelse fra BioMed Central, figur 2 og 3, og tabell 1 med tillatelse fra S. Karger AG, Basel, og figur 4 og 5 ble gjengitt eller tilpasses med tillatelse fra John Wiley & Sons, Inc (copyright eies av Wiley- Blackwell, 2011).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Medimachine system | BD | 340587 | |
| Medicon unit (50 μm) | BD | 340591 | |
| Filcon unit (50 μm) | BD | 340603 | |
| DMEM | Gibco | 430-2100 | |
| Fetal calf serum | PAA | A11-151 | |
| NDA | Chemos BmbH | 277081 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | 287075 | Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml |
Riferimenti
- Meistrich, M. L., Prescott, D. M. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. 15, 15-54 (1977).
- Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
- Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
- Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
- Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
- Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
- Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).
