से मस्तिष्क तनहा Leukocytes का अलगाव विश्लेषण<em> प्लाज्मोडियम berghei</em> ANKA संक्रमित चूहे
Summary
मस्तिष्क की रक्त वाहिकाओं से पक्षपाती भड़काऊ leukocytes के अलगाव के लिए एक विधि<em> प्लाज्मोडियम berghei</em> ANKA संक्रमित चूहों में वर्णित है. विधि प्रवाह cytometry द्वारा फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी और बाद के विश्लेषण के साथ धुंधला करने के बाद अलग leukocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्ररूपी लक्षण वर्णन मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है.
Abstract
हम अलगाव और पी. के मस्तिष्क रक्त वाहिकाओं से पक्षपाती भड़काऊ कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए एक विधि का वर्णन berghei ANKA संक्रमित चूहों. प्रयोगात्मक मस्तिष्क मलेरिया की प्रेरण, एक neurologic सिंड्रोम में इस परजीवी तनाव परिणामों के साथ अतिसंवेदनशील माउस उपभेदों के संक्रमण recapitulates प्लाज्मोडियम फाल्सीपेरम की मध्यस्थता मनुष्य के 1,2 में गंभीर मलेरिया के कुछ महत्वपूर्ण पहलुओं कि. परिपक्व रक्त चरण मलेरिया की रूपों संक्रमित एरिथ्रोसाइट, जो उन्हें संवहनी endothelial कोशिकाओं को बाध्य करने के लिए अनुमति देता है की सतह पर परजीवी प्रोटीन व्यक्त करते हैं. इस प्रक्रिया में रक्त के प्रवाह में अवरोधों लाती है, जिसके परिणामस्वरूप hypoxia और 3 haemorrhages में और भी परजीवी ज़ब्ती की साइट पर भड़काऊ leukocytes की भर्ती को बढ़ावा देने.
अन्य संक्रमण, यानी neutrotopic 4-6 वायरस के विपरीत, दोनों मलेरिया parasitized लाल रक्त कोशिकाओं (pRBC) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जुड़े inflammatory leukocytes रक्त वाहिकाओं के बजाय भीतर मस्तिष्क पैरेन्काइमा घुसपैठ से तनहा रहते हैं. इस प्रकार की गैर भड़काऊ परिसंचारी कोशिकाओं, संक्रमित चूहों के व्यापक intracardial छिड़काव अंग निष्कर्षण और ऊतक प्रसंस्करण के लिए पहले के साथ तनहा leukocytes के संक्रमण से बचने के लिए इस प्रक्रिया में रक्त डिब्बे को हटाने की आवश्यकता है. छिड़काव के बाद, दिमाग और खेती कर रहे हैं और छोटे – छोटे टुकड़ों में dissected. ऊतक संरचना Collagenase विकास और DNase मैं के साथ enzymatic उपचार से बाधित है जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क homogenate तो एक Percoll ढाल है कि मस्तिष्क तनहा leukocytes की myelin और अन्य ऊतकों मलबे से जुदाई (BSL) की अनुमति देता है पर centrifuged है. पृथक कोशिकाओं को फिर धोया जाता है, प्रवाह cytometry द्वारा बाद के विश्लेषण के लिए एक और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ hemocytometer दाग गिनती का उपयोग.
इस प्रक्रिया भड़काऊ leukocytes के व्यापक प्ररूपी लक्षण वर्णन पुनः में दिमाग की ओर पलायन करने की अनुमति देता हैस्ट्रोक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वायरल या परजीवी के संक्रमण सहित विभिन्न stimuli, sponse. विधि भी पूर्व नैदानिक पशु मॉडल में उपन्यास विरोधी भड़काऊ उपचार के मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
बीएसएल अलगाव और विश्लेषण एक तरीका है कि लक्षण वर्णन और सूजन ऊतक या प्रयोगात्मक माउस मॉडल में चोट संक्रमण जवाब में मस्तिष्क के लिए पलायन कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है. अंग निष्कर्षण और ब…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों के लिए तकनीकी सहायता के लिए मिस लता Mackiewicz धन्यवाद करना चाहते हैं. यह काम विक्टोरियन राज्य सरकार परिचालन बुनियादी सुविधाओं समर्थन और ऑस्ट्रेलियाई सरकार राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद IRIISS और परियोजना 1031212 अनुदान के माध्यम से संभव बनाया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Solutions and buffers | |||
| Giemsa’s azur eosin methylene blue solution | Merck Millipore | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in distilled water |
| RPMI medium | Mouse tonicity | ||
| Mouse tonicity PBS | 20 mM Sodium Phosphate, 0.149 NaCl, pH 7.3 | ||
| 0.4%Trypan Blue | Sigma Aldrich | T-8154 | 1:2 dilution |
| Collagenase D | Worthington Biochemical | ||
| Deoxyribonuclease (DNAse) I | Sigma Aldrich | D4263-5VL | From bovine pancreas |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | 30% solution in PBS |
| Ultrapure Tris | Invitrogen | 15505-020 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | AnalaR | 10017 | |
| Red Cell Lysis Buffer | 17 mM Tris,14 nM NH4Cl, pH 7.2 | ||
| FCS | Gibco | 1009 | |
| EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
| Antibodies and conjugates | |||
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block), clone 2.4G2 | BD Pharmingen | 553142 | 1 μl in 50 μl staining buffer (0.5 mg/50 ml) |
| FITC-anti-mouse CD4, clone H129.19 | BD Pharmingen | 553651 | |
| PE-anti-mouse NK1.1, clone PK136 | BD Pharmingen | 553165 | |
| PerCPCy5.5-anti-mouse CD8, clone 53-6-7 | BD Pharmingen | 551162 | |
| APC-anti-mouse TCR-β, clone H57-597 | BD Pharmingen | 553174 | |
| PE-anti-mouse CXCR3, clone 220803 | R&D Systems | FAB1685P | |
| Biotinylated-anti-mouse CCR5, clone C34-3448 | BD Pharmingen | 559922 | |
| Steptavidin-PerCP-Cy5.5 | BD Pharmingen | 551419 | |
| Equipment and material | |||
| SuperFrost microscope slide | Lomb Menzel-Gläser | ||
| Dissection forceps, scissors | REDA Instrumente | ||
| 500 ml PBS reservoir | Nalgene | ||
| Rubber tubing | |||
| 23G needle | BD PrecisionGlide | 302008 | |
| Cell dissociation kit containing metal sieve | Sigma Aldrich | CD-1 | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Hemocytometer | GmbH Neubauer | 717810 | |
| Flow cytometry tubes | BD Falcon | 352008 |
Riferimenti
- Brian de Souza, J., Riley, E. M. Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis. Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).
- Schofield, L., Grau, G. E. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nature. 5, 722-735 (2005).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415, 673-679 (2002).
- Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. Journal of neuroinflammation. 9, 50 (2012).
- LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes. J. Vis. Exp. (52), e2747 (2011).
- Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. West Nile virus: immunity and pathogenesis. Viruses. 3, 811-828 (2011).
- Belnoue, E., et al. On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria. Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).
- Campanella, G. S., et al. Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).
- Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria. Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).
- Amante, F. H., et al. A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria. The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).
- Nie, C. Q., et al. IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection. PLoS pathogens. 5, e1000369 (2009).
- Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).
- Nitcheu, J., et al. Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis. Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).
- Lundie, R. J., et al. Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells. Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).
