Come le reti neuronali sono stabiliti nel cervello embrionale è una questione fondamentale nella neurobiologia dello sviluppo. Qui abbiamo combinato una tecnica di elettroporazione con nuovi strumenti genetici, come ad esempio Cre / Lox-plasmidi e PiggyBac-mediata sistema trasposizione del DNA nel romboencefalo aviaria di etichettare interneuroni dorsali e monitorare le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche a vari stadi di sviluppo.
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Articolo metodologico
Elettroporazione del romboencefalo tracciare traiettorie assonale e Obiettivi Synaptic in embrione di pollo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Elettroporazione del pulcino embrionale tubo neurale ha molti vantaggi come essere veloce ed efficiente per l'espressione di geni estranei in cellule neuronali. In questo manoscritto forniamo un metodo che dimostra univocamente come l'elettroporazione di DNA nel cervello posteriore aviaria in E2.75, al fine di etichettare specificamente un sottoinsieme di progenitori neuronali, e come seguire le loro proiezioni assonali e traguardi sinaptiche in Gran fase avanzata di sviluppo, fino a E14.5. Abbiamo utilizzato nuovi strumenti genetici tra cui specifici elementi enhancer, Cre / Lox - plasmidi base e il sistema di recepimento DNA PiggyBac-mediata di guidare l'espressione della GFP in un sottotipo di cellule romboencefalo (la dorsale più sottogruppo di interneuroni, DA1). Traiettorie e target di DA1 assoni assonale sono seguiti a inizio e fine fasi embrionali in varie regioni del tronco encefalico. Questa strategia contribuisce tecniche avanzate per il targeting di cellule di interesse nel romboencefalo embrionale e per il TRACing formazione circuito a più stadi di sviluppo.
Introduzione
Romboencefalo rappresenta un mozzo relè chiave del sistema nervoso comunicando tra il sistema nervoso centrale e periferico tramite ascendente e discendente reti neuronali. Esso regola le funzioni di base tra cui la respirazione, la coscienza, l'udito, e la coordinazione motoria 1-3. Durante lo sviluppo embrionale precoce, la romboencefalo vertebrati viene transitoriamente suddiviso lungo il suo asse antero-posteriore (AP) in rhombomeres ripetitivi, in cui si formano diversi tipi di cellule neuronali e generano molteplici centri nuclei del tronco cerebrale 4. Il cervello posteriore è diviso lungo il suo asse dorso-ventrale (DV) in una piastr....
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Protocollo
1. Romboencefalo elettroporazione
1.1 gestione Egg
- Mettere le uova orizzontalmente in un incubatore umidificato (37-38,5 ° C). Gli embrioni sono elettroporati dopo 65-70 ore di incubazione, quando raggiungono 16-17 (HH) stadio (25-30 somiti).
- Togliere le uova dal termostato, rimangono in posizione orizzontale.
1.2 Preparativi
- Tirare vetro capillari (0,5 mm di diametro).
- Collegare piegati a forma di L oro Genetrodes elettrodi (3 mm di diametro) con un supporto adattatore per il generatore di impulsi. Parametri di elettroporazione sono 25 volt, 5 numeri di impulsi, 45 ....
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Risultati
Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per scoprire i modelli assonale e siti di proiezione di DA1 sottogruppo di interneuroni nella romboencefalo pulcino 10. Per etichettare specificamente questi assoni, un elemento enhancer (Atoh1), che è stata precedentemente caratterizzata da specifici per i neuroni spinali DI1 8,12,13, è stato confermato da esprimere in romboencefalo DA1 cellule 10. L'elemento è stato clonato a monte di Cre ricombinasi e co-elettroporato a E2.75 insie.......
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Discussione
In elettroporazione ovo è uno strumento fattibile, affidabile ed efficace per esaminare le specifiche delle cellule e la guida assonale durante pulcino sviluppo del sistema nervoso 20. In questo protocollo si descrive una modalità di elettroporazione in romboencefalo pulcino a E2.75 utilizzando elementi enhancer che consentano l'etichettatura condizionale di interneuroni specifici. Questa strategia è combinato con il sistema di recepimento PiggyBac-mediata di inserire geni estranei nel g.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dott. Yuval Gottlieb-Dror per l'illustrazione elettroporazione. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a DSD presso l'Istituto Nazionale per la Psicobiologia in Israele e dal programma di cooperazione di ricerca Niedersachsen-Israele e da sovvenzioni per AK da The Israel Science Foundation, il Ministero Israele di salute, e il centro di eccellenza del Patrimonio-Legacy Biomedical Science collaborazione.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Elettrodi da 3 mm Genetrodes in oro a forma di L | BTX, Harvard Apparatus | 45-0162 | |
| generatore di impulsi, ECM 830 | BTX, Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| OCT (temperatura di taglio ottimale) Compound | Tissue-Tek | Sakura 4583 O.C.T. Smalto composto | |
| da qualsiasi fornitore commerciale |
Riferimenti
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the precerebellar nuclei in the rat: II. The intramural olivary migratory stream and the neurogenetic organization of the inferior olive. J. Comp. Neurol. 257, 490-512 (1987).
- Rose, M. F., Ahmad, K. A., Thaller, C., Zoghbi, H. Y.
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Ristampe e permessi
