La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales
Summary
Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l'obtention de matériel d'étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l'analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d'autres applications analytiques.
Abstract
Interactions physiques entre les lipides incorporés hélice alpha domaines de protéines membranaires jouent un rôle crucial dans le repliement et l'assemblage des complexes protéiques membranaires et dans des processus dynamiques tels que transmembranaire (TM) de signalisation et de régulation de la teneur en protéines de la surface cellulaire. Comprendre les caractéristiques structurelles de conduite de l'association des séquences particulières nécessite des analyses sophistiquées biophysiques et biochimiques de complexes peptidiques TM. Cependant, l'hydrophobie extrême de domaines TM rend très difficile à manipuler à l'aide des techniques standard de chimie des peptides, et la production de matériel d'étude approprié s'avère souvent prohibitif difficile. Identifier les conditions dans lesquelles les peptides peuvent adopter des conformations hélicoïdales stables et forment des complexes ajoute spontanément un autre niveau de difficulté. Nous présentons ici un procédé pour la production d'homo-ou hétéro-dimères complexes peptidiques TM à partir de matériaux qui sont exprimées dans E. coli, ce qui permet l'incorporation de marqueurs isotopiques stables pour la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou non-naturelles des acides aminés pour d'autres applications relativement peu de frais. La principale innovation de cette méthode est que les complexes de MC sont produites et purifiées comme covalente disulfure associés (réticulé) qui peuvent former des assemblages de structures stables, stoechiométrique et homogène après reconstitution dans un détergent, lipides ou d'autres matériaux de membrane-mimétiques. Nous présentons également des procédures soigneusement optimisés pour l'expression et la purification qui sont également applicables si la production de simples domaines TM ou complexes réticulés et donner des conseils pour adapter ces méthodes à de nouvelles séquences TM.
Introduction
Ce protocole détaille une procédure que nous avons développé pour produire des complexes disulfure stabilisées transmembranaire (TM) de peptides destinés à des études structurales par RMN solution. La procédure prend avantage de l'expression robuste offerte par le système ΔtrpLE1413 fusion (voir ci-dessous) et permet des complexes peptidiques TM de composition définie pour être générés en utilisant des techniques sophistiquées d'étiquetage des isotopes stables pour les modernes des expériences de RMN multidimensionnelles. Nous avons utilisé ces techniques pour déterminer les structures RMN plusieurs qui ont révélé de nouveaux renseignements importants sur la façon d'activation des lymphocytes immunorécepteurs sont assemblées à partir de plusieurs sous-unités de protéines membranaires par des interactions entre leurs domaines TM (récemment revu à 1). Ces techniques sont applicables à de nombreux autres systèmes de protéines membranaires, ainsi que toute une gamme de méthodes analytiques en aval, en plus de RMN en solution. Bien que l'exemple donné ici utilise des résidus cystéine nativespour créer un complexe qui imite la nature liaisons disulfure des protéines, le design est aussi bien adapté pour la création de ponts disulfures d'ingénierie pour stabiliser des complexes qui sont normalement maintenues ensemble par des faibles, des interactions non covalentes comme homo-et hétéro-dimères complexes de MC Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-protéines de la famille ou des hétérodimères αβ 04.02 complexes intégrines 5,6.
Extrêmement séquences peptidiques hydrophobes tels que ceux issus de la bicouche lipidique, couvrant des portions de protéines TM sont des sujets extrêmement difficiles pour les études biochimiques et biophysiques. En plus d'être très difficile à manipuler à l'aide de protéines standard et des techniques de chimie des peptides, ils sont souvent très toxiques pour les cellules et sont donc difficiles à produire par recombinaison. Nous et les autres 7,8 9-11 ont connu un succès important en exprimant ces séquences peptidiques difficiles chez les bactéries que dans le même cadre carboxy-terminalefusions avec une version modifiée de la séquence dérivée de la ΔtrpLE1413 E. coli opéron trp 12. Le polypeptide ~ 13 kDa trpLE codée par cette séquence peut être produite à des niveaux élevés en vertu d'un promoteur T7 et est entièrement localisée à corps d'inclusion où les problèmes liés à la toxicité et / ou d'instabilité sont contournées. Modification de la séquence par l'addition d'un amino-terminale 9-histidine étiquette 13 et l'élimination des résidus internes de méthionine et de cystéine de la séquence trpLE 14 souhaités trpLE-peptide fusions d'être purifiés par des ions métalliques et la chromatographie d'affinité digéré à l'aide de bromure de cyanogène (CNBr ) pour libérer la séquence peptidique désirée. Nous avons utilisé avec succès ce système pour exprimer plus d'une douzaine de séquences différentes sous forme de fusions trpLE représentant des fragments de protéines membranaires qui contiennent moins de quatre domaines TM (7,8 et résultats non publiés; voir également la section Discussion).
Lainnovation majeure dans ce protocole est l'identification des conditions dans lesquelles les non-structurées et très peu soluble trpLE-TM fusions peuvent être efficacement disulfure réticulé dans le contexte d'un flux de travail optimisé. Plusieurs aspects de l'expression à haut rendement, la manipulation et la purification des produits peptidiques ont également été soigneusement optimisé, ainsi que les recommandations présentées ici sont tout aussi pertinentes pour la production de disulfure non-réticulés (monomère) produits peptidiques TM.
Protocol
Representative Results
Discussion
Expression de trpLE-TM fusions. D'après notre expérience, trpLE-TM fusions sont mal exprimé dans un milieu de culture riche à 37 ° C, et les conditions de culture décrites ici ont fait leurs preuves pour de nombreuses séquences différentes contenant de une à quatre domaines TM avec des rendements allant 50 à 150 mg / L de pur, de fusion intacte. Fusions encodage de trois ou quatre fragments TM RCPG (CCR5 humain TM1-TM3 et TM4-TM7, respectivement) ou un fragment de noyau catalytique de peptidase du…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement de ce travail est assuré par la National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC projet de subvention à 1011352 MEC et MJC; Independent Research Institutes programme de soutien des infrastructures [IRIISS] subvention à WEHI) et le gouvernement du Victoria (VESKI Innovation Bourse de MEC; gouvernement de l'État de Victoria Soutien opérationnel Infrastructure à WEHI). MEC est une reine Elizabeth II Fellow de l'Australian Research Council. EFXB reconnaît l'appui du Programme des bourses d'études Norma Hilda Schuster à l'Université de Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
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