Produksjon av disulfide-stabilisert transmembrane Peptid Komplekser for Strukturelle studier
Summary
Biofysiske og biokjemiske studier av samspill mellom membran-innebygde protein domener står overfor mange tekniske utfordringer, hvorav den første er å skaffe riktig studie materiale. Denne artikkelen beskriver en protokoll for fremstilling og rensing av disulfid-stabiliserte transmembrane peptid komplekser som er egnet for strukturell analyse av oppløsning nukleær magnetisk resonans (NMR) og andre analytiske programmer.
Abstract
Fysiske samspill mellom lipid-innebygde alpha-helical domener av membran proteiner spiller en avgjørende rolle i folding og montering av membran protein komplekser og i dynamiske prosesser som transmembrane (TM) signal og regulering av celle-overflate protein nivåer. Forstå strukturelle trekk som driver foreningen av bestemte sekvenser krever avanserte biofysiske og biokjemiske analyser av TM peptid komplekser. Imidlertid gjør den ekstreme hydrofobitet for TM domener dem svært vanskelig å manipulere med standard peptidkjemi teknikker, og produksjon av passende studie materiale ofte viser uoverkommelig utfordrende. Identifisere hvilke vilkår peptider kan vedta stabile spiralformede conformations og form komplekser legger spontant en ytterligere vanskelighetsgrad. Her presenterer vi en prosedyre for fremstilling av homo-eller hetero-dimeriske TM peptid komplekser fra materialer som er uttrykt i E. coli, således tillater inkorporering av stabile isotopen etiketter for nukleær magnetisk resonans (NMR) eller ikke-naturlige aminosyrer for andre programmer relativt billig. Nøkkelen innovasjon i denne metoden er at TM komplekser produsert og renset som kovalent assosierte (disulfid-kryssbundet) sammenstillinger som kan danne stabile, støkiometrisk og homogen strukturer når rekonstituert inn vaskemiddel, lipid eller andre membran-mimetiske materialer. Vi presenterer også nøye optimalisert prosedyrer for uttrykk og rensing som er like anvendelige enten produsere enkle TM domener eller kryssbundet komplekser og gi råd for å tilpasse disse metodene til nye TM sekvenser.
Introduction
Denne protokollen detaljer en prosedyre vi har utviklet for å produsere disulfid-stabiliserte komplekser av transmembrane (TM) peptider for strukturelle studier med løsning NMR. Prosedyren tar fordel av den robuste uttrykket som gis gjennom den ΔtrpLE1413 fusion system (se nedenfor) og tillater TM peptid komplekser av definert sammensetning som skal genereres ved hjelp av avanserte stabil-isotope merkingsteknikker for moderne multi-dimensjonale NMR eksperimenter. Vi har ansatt disse teknikkene for å bestemme flere NMR strukturer som avslørte ny og viktig informasjon om hvordan lymfocytt-aktiverende immunoreceptors er samlet fra flere membran protein subenheter gjennom samspill mellom sine TM domener (nylig gjennomgått i 1). Disse teknikkene er gjeldende for mange andre membran protein systemer samt et bredt utvalg av nedstrøms analysemetoder i tillegg til løsning NMR. Mens eksempel gitt her benytter innfødte cysteinresterå skape et komplekst som etterligner naturlig disulfid-limt protein, er utformingen like godt egnet for å skape konstruert disulfidbindinger å stabilisere komplekser som normalt holdes sammen av svakere, ikke-kovalente interaksjoner som homo-og hetero-dimeriske TM komplekser av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR)-familien proteiner 2-4 eller heterodimere αβ integrin komplekser 5,6.
Ekstremt hydrofobe peptidsekvenser slik som de avledet fra lipid bilayer-spenner delene for TM proteiner er overmåte vanskelige fag for biokjemiske og biofysiske studier. I tillegg til å være svært utfordrende å manipulere ved hjelp av standard protein og peptid kjemi teknikker, er de ofte ganske giftig for celler og er derfor vanskelig å produsere rekombinant. Vi 7,8 og andre 9-11 har hatt betydelig suksess uttrykker slike vanskelige peptidsekvenser i bakterier som i-frame karboksy-terminalfusjoner til en modifisert versjon av ΔtrpLE1413 sekvensen avledet fra E. coli trp operon 12. Den ~ 13 kDa trpLE polypeptid kodet for av denne sekvensen kan produseres ved høye nivåer under en T7 promoter og er i sin helhet lokalisert til inklusjonslegemer der problemer knyttet til toksisitet og / eller ustabilitet blir omgått. Modifisering av sekvensen ved tilsetning av en amino-terminal 9-histidin tag 13 og eliminering av interne metionin og cystein rester fra trpLE sekvensen 14 medbringes trpLE-peptid fusjoner å renses ved metall-ion affinitetskromatografi og fordøyd med cyanogenbromid (CNBr ) for å frigjøre den ønskede peptidsekvens. Vi har med hell brukt dette systemet til å uttrykke mer enn et dusin forskjellige sekvenser som trpLE fusjoner representerer membran protein fragmenter som inneholder så mange som fire TM domener (7,8 og upubliserte resultater, se også DISKUSJON avsnitt).
DenNøkkelen innovasjon i denne protokollen er identifisering av forholdene som ustrukturerte og svært dårlig løselig trpLE-TM fusjoner kan være effektivt disulfid-kryssbundet i sammenheng med en strømlinjeformet arbeidsflyt. Flere aspekter av high-yield uttrykk, håndtering og rensing av peptid produkter har også blitt grundig optimalisert, og anbefalingene som presenteres her er like relevant for produksjon av ikke-disulfid-tverrbundede (monomere) TM peptid produkter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uttrykk for trpLE-TM fusjoner. Vår erfaring er trpLE-TM fusjoner dårlig uttrykt i rike kultur medium ved 37 ° C, og kultur forholdene beskrevet her har vist seg vellykket for mange forskjellige sekvenser som inneholder 1-4 TM domener med avkastning spenner 50-150 mg / L av ren, intakt fusion. Fusions koding tre-eller fire-TM GPCR fragmenter (human CCR5 TM1-TM3 og TM4-TM7, henholdsvis) eller en kjerne katalytisk fragment av menneskelig signal peptid peptidase (fire TM-domener, se ref 15) represente…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Midler til dette arbeidet er levert av National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC prosjektstøtte 1.011.352 til MEC og MJC, forskningsinstitutter Infrastruktur støtteordning [IRIISS] tilskudd til WEHI) og den viktorianske regjeringen (Veski Innovation Fellowship til MEC; Victorian State Government Operasjonell Infrastruktur Støtte til WEHI). MEC er en dronning Elizabeth II medlem av Australian Research Council. EFXB erkjenner støtte fra Norma Hilda Schuster Scholarship Program ved University of Melbourne.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Cyanogen bromide | ALDRICH | P.No- C91492,CAS-506-68-3 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA-ALDRICH | P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 2-Mercaptoethanol | SIGMA-ALDRICH | P.No M7154, CAS Number 60-24-2 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment. |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol | SIGMA-ALDRICH | Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1 | HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns. |
| Formic acid | Merck KGaA | K41186564 | Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
| Urea | UNIVAR, AJAX FINECHEM | Product Number, 817, CAS-No 57-13-6 | When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes. |
| GUANIDINE HYDROCHLORIDE | Amresco | P.No-M110, CAS Number: 50-01-1 | Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant. |
| TRITON X-100 | SIGMA | Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1 | Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent |
| His-Select Nickel-Affinity gel | SIGMA-ALDRICH | Catalog Num- P6611 | IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins. |
| (-)-Glutathione, oxidized | SIGMA-ALDRICH | Catalog num 150568 | |
| Misonix S-3000 sonicator | QSONICA | S-3000 (discontinued) | Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700. |
| RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3 | Bio-Rad Laboratories | Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705 | Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent. |
| Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size | Agilent | Product No: 895150-909 | Reversed-phase HPLC colum |
| NuPAGE 12% Bis-Tris Gels | Life Technologies | NP0341BOX | Pre cast gels for protein electrophoresis |
| Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO | Thermo Scientific | Product No: 87724 | Sample dialysis |
Riferimenti
- Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
- Bocharov, E. V., et al. Spatial structure of the dimeric transmembrane domain of the growth factor receptor ErbB2 presumably corresponding to the receptor active state. The Journal of Biological Chemistry. 283, 6950-6956 (2008).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure of the transmembrane domain heterodimer of ErbB1 and ErbB2 receptor tyrosine kinases. J. Mol. Biol. 400, 231-243 (2010).
- Mineev, K. S., et al. Spatial structure and dimer–monomer equilibrium of the ErbB3 transmembrane domain in DPC micelles. Biochim. Biophys Acta. 1808, 2081-2088 (2011).
- Lau, T. L., Kim, C., Ginsberg, M. H., Ulmer, T. S. The structure of the integrin alphaIIbbeta3 transmembrane complex explains integrin transmembrane signalling. The EMBO Journal. 28, 1351-1361 (2009).
- Zhu, J., et al. The structure of a receptor with two associating transmembrane domains on the cell surface: integrin alphaIIbbeta3. Molecular Cell. 34, 234-249 (2009).
- Call, M. E., et al. The structure of the zetazeta transmembrane dimer reveals features essential for its assembly with the T cell receptor. Cell. 127, 355-368 (2006).
- Call, M. E., Wucherpfennig, K. W., Chou, J. J. The structural basis for intramembrane assembly of an activating immunoreceptor complex. Nat. Immunol. 11, 1023-1029 (2010).
- Diefenderfer, C., Lee, J., Mlyanarski, S., Guo, Y., Glover, K. J. Reliable expression and purification of highly insoluble transmembrane domains. Anal. Biochem. 384, 274-278 (2009).
- Schnell, J. R., Chou, J. J. Structure and mechanism of the M2 proton channel of influenza A virus. Nature. 451, 591-595 (2008).
- Xie, X. Q., Zhao, J., Zheng, H. E. x. p. r. e. s. s. i. o. n. purification, and isotope labeling of cannabinoid CB2 receptor fragment, CB2(180-233). Protein Expr. Purif. 38, 61-68 (2004).
- Miozzari, G. F., Yanofsky, C. Translation of the leader region of the Escherichia coli tryptophan operon. J. Bacteriol. 133, 1457-1466 (1978).
- North, C. L., Blacklow, S. C. Structural independence of ligand-binding modules five and six of the LDL receptor. Biochimica. 38, 3926-3935 (1999).
- Staley, J. P., Kim, P. S. Formation of a native-like subdomain in a partially folded intermediate of bovine pancreatic trypsin inhibitor. Protein Sci. 3, 1822-1832 (1994).
- Narayanan, S., Sato, T., Wolfe, M. S. A C-terminal region of signal peptide peptidase defines a functional domain for intramembrane aspartic protease catalysis. The Journal of Biological Chemistry. 282, 20172-20179 (2007).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s beta-amyloid protein is covalently modified when dissolved in formic acid. J. Neurochem. 54, 2050-2056 (1990).
- Klunk, W. E., Xu, C. J., Pettegrew, J. W. NMR identification of the formic acid-modified residue in Alzheimer’s amyloid protein. J. Neurochem. 62, 349-354 (1994).
- Previero, A., Coletti-Previero, M. A., Cavadore, J. C. A reversible chemical modification of the tryptophan residue. Biochim. Biophys. Acta. 147, 453-461 (1967).
- Kim, H. J., Howell, S. C., Van Horn, W. D., Jeon, Y. H., Sanders, C. R. Recent Advances in the Application of Solution NMR Spectroscopy to Multi-Span Integral Membrane Proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 55, 335-360 (2009).
