Contínua observação microscópica de alta resolução de replicativa envelhecimento em leveduras de brotamento
Summary
Nós descrevemos aqui a operação de um dispositivo de microfluidos, que permite contínua e de elevada resolução de imagem microscópica de células de levedura de brotamento individuais durante a sua replicativo completo e / ou o tempo de vida cronológica.
Abstract
Nós demonstramos a utilização de uma configuração de microfluidos simples, no qual as células de levedura de brotamento individuais podem ser rastreados em todo o seu tempo de vida. O chip de microfluídica explora a diferença de tamanho entre as células mãe e filha usando uma matriz de micropads. Após a carga, as células são presos debaixo destas micropads, porque a distância entre o microPad e tampa de vidro é semelhante ao diâmetro de uma célula de levedura (3-4 mm). Após o procedimento de carregamento, meio de cultura é continuamente perfundido através do chip, o que não só cria um ambiente constante e definida ao longo de toda a experiência, mas também elimina as células filhas emergentes, que não são retidas por baixo das almofadas, devido ao seu menor tamanho. A configuração retém células mãe tão eficientemente que numa única experiência de até 50 células individuais podem ser monitorizados de um modo totalmente automático, durante 5 dias, ou, se necessário, mais longo. Além disso, as propriedades ópticas excelentes do chip permitir altaResolução de imagem de células durante todo o processo de envelhecimento.
Introduction
Brotação de levedura é um organismo modelo importante para o envelhecimento investigação 1. Até recentemente, o estudo de envelhecimento replicativo em células de levedura era um processo laborioso que requer um método de esvaziamento, em que cada botão era removido manualmente a partir da célula mãe 2,3. Para resolver este problema, que recentemente apresentou um novo configuração microfluídicos capaz de rastrear células mãe individuais ao longo de toda sua vida útil 4.
Em nosso chip de microfluídica, células de levedura são presos sob micropads suaves à base de elastómeros (ver Figura 1). Um fluxo contínuo de meio de lava filha células recém-formadas e fornece as células com nutrientes frescos. Numa única experiência, até 50 células-mãe pode ser monitorizado de uma maneira completamente automatizada em todo o seu tempo de vida replicativo. Devido às excelentes propriedades ópticas do chip de microfluidos, é possível monitorizar simultaneamente diferentes aspectos da biologia das células de levedura (por exemplo, </em> usando proteínas fluorescentes).
Comparado com o método clássico de dissecção, a configuração de microfluidos proporciona vantagens substanciais. Ela garante um ambiente definido e constante durante todo o experimento de envelhecimento. Não requer nenhum equipamento especializado caro e pode ser executado em qualquer microscópio equipado com foco automático e capacidade de lapso de tempo, bem como de controle de temperatura para o cultivo celular. A produção e operação dos chips microfluidicos podem ser aprendidas dentro de poucos dias. Além disso, as células podem ser carregadas directamente a partir de uma cultura em crescimento exponencial, uma vantagem sobre um outro método de microfluidos recentemente publicado em 5, que requer a biotinilação das células-mãe. Combinado com uma imagem de alta resolução, o método aqui descrito pode ser usado para medir as alterações graduais na morfologia celular, expressão de proteína de levedura e localização durante o envelhecimento de uma forma sem precedentes. A capacidade paramonitoramento de longo prazo de células individuais também oferece possibilidades únicas para estudos do ciclo celular de levedura.
um Este método foi recentemente optimizado para remover a biotinilação do protocolo de 16, que foi publicada durante este manuscrito foi em avaliação.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método de microfluídica aqui descrito é uma nova ferramenta importante na pesquisa do envelhecimento, uma vez que permite a geração simples e automatizado de dados expectativa de vida replicativo fermento em combinação com imagens de alta resolução contínua. Estes atributos são importantes melhoramentos em relação às possibilidades experimentais do método de dissecação clássico, ainda existem algumas limitações do método, que devem ser tidos em conta.
Note-se que o tem…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Laura Schippers para escrever as primeiras versões do protocolo de carga celular e Marcus de Goffau e Guille Zampar por atingir morfologias mitocondriais.
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | This package contains PDMS base and PDMS curing agent. |
| Glass Petri dishes 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Cover glasses 22×40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminum foil | |||
| Plastic disposable cup | |||
| Serological pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch tape | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone paste (GE Bayer silicones) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE microbore tubing, 0.012″ID x 0.030″OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Referred to as thin tubing |
| Tygon microbore Tubing, 0.030″ID x 0.090″OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Referred to as thick tubing |
| Scalpel | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok syringes | BD | 300137 | |
| 5 ml syringes, Luer tip | VWR International | 613-1599 | |
| Tweezers | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Syringe filters (pore size 0.20 μm) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri dishes | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 silicon master mold (wafer) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Hot plate | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metal holder for cover glass (22×40 mm) | Self-made; For details contact corresponding author | ||
| (Fluorescence) Microscope with 60x objective, autofocus, time-lapse abilities and preferably an automated (motorized XY control) stage | Nikon | Eclipse Ti-E |
Riferimenti
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