केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र में एकल कक्षों के लेबल<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Summary
हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में एकल न्यूरॉन्स की लेबलिंग के लिए एक तकनीक (सीएनएस) उपस्थित<em> ड्रोसोफिला</em> भ्रूण है, जो या तो प्रेषित प्रकाश या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा neuronal आकारिकी विश्लेषण की अनुमति देता है.
Abstract
हम इस लेख में वर्णन कैसे व्यक्तिगत रूप ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर lipophilic फ्लोरोसेंट झिल्ली मार्कर DiI juxtacellular इंजेक्शन द्वारा भ्रूण सीएनएस में न्यूरॉन्स लेबल. इस विधि महान विस्तार में neuronal सेल morphology के दृश्य की अनुमति देता है. यह CNS में किसी भी सेल लेबल के लिए संभव है: लक्ष्य न्यूरॉन्स की कोशिका निकायों डीआईसी प्रकाशिकी के तहत या GFP के रूप में एक फ्लोरोसेंट आनुवंशिक मार्कर की अभिव्यक्ति द्वारा कल्पना कर रहे हैं. लेबलिंग के बाद, DiI photoconversion द्वारा एक स्थायी दाग भूरे रंग में तब्दील किया जा सकता है प्रेषित प्रकाश और डीआईसी प्रकाशिकी के साथ सेल आकारिकी के दृश्य की अनुमति. वैकल्पिक रूप से, DiI लेबल कोशिकाओं confocal माइक्रोस्कोपी के साथ सीधे देखा जा सकता है, आनुवंशिक रूप से शुरू की फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन colocalised जा करने के लिए सक्षम है. तकनीक किसी भी जानवर में इस्तेमाल किया जा सकता है, जीनोटाइप के बावजूद, यह एकल कक्ष संकल्प संभव उत्परिवर्ती phenotypes का विश्लेषण करने के लिए कर रही है.
Introduction
Neuronal आकारिकी व्यक्ति की कोशिकाओं के स्तर पर ज्ञान neuronal कनेक्टिविटी और CNS समारोह को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है. इस प्रकार, तंत्रिका विज्ञान के जल्द से जल्द दिनों से, शोधकर्ताओं ने एकल कक्ष लेबलिंग तकनीक (इस मुद्दे का एक ऐतिहासिक उपचार के लिए 7 देखें) को विकसित करने की मांग की है. Golgi धुंधला हो जाना जैसे शास्त्रीय तरीकों neuronal आकारिकी उत्कृष्ट संकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन उपयुक्त है अगर एक एक निर्देश रास्ते में न्यूरॉन के एक विशेष प्रकार के लेबल, के रूप में धुंधला हो जाना एक यादृच्छिक फैशन में होता है चाहता है नहीं कर रहे हैं. intracellular या एक microelectrode से रंगों का juxtacellular इंजेक्शन द्वारा एकल कक्षों को धुंधला करने के लिए तरीकों के विकास के विशिष्ट लेबलिंग की आवश्यकता को संबोधित किया.
एकल न्यूरॉन डाई इंजेक्शन के ड्रोसोफिला के लिए आवेदन दोनों जीव और उसके न्यूरॉन्स के छोटे आकार की वजह से एक बड़ी चुनौती प्रस्तुत किया. बहरहाल, भ्रूण ड्रोसोफिला के एकल न्यूरॉन धुंधला हो जाना </em> न्यूरॉन्स 1980 के मध्य में कोरी गुडमैन 15 की प्रयोगशाला में हासिल की थी. जबकि विधि खासे उपयोगी किया गया है और ड्रोसोफिला में पिछले 20-30 साल (2 उदाहरण के लिए, 10) पर neuronal विकास के लिए तंत्र में कुछ महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की, कई कार्यकर्ताओं दूर से बचते रहे हैं मोटे तौर पर अपनी तकनीकी मांग की वजह से है.
ड्रोसोफिला में neuronal लेबलिंग के लिए आनुवंशिक तकनीक के और हाल के वर्षों में उपलब्धता भी एकल न्यूरॉन डाई इंजेक्शन की अलोकप्रियता के लिए योगदान दिया है. लक्षित GFP constructs झिल्ली GAL4 निर्देशित अभिव्यक्ति तंत्रिका आकारिकी 1, 20 के उत्कृष्ट संकल्प प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, इस पद्धति कुछ सीमाएँ हैं: अक्सर कई कोशिकाओं में GFP की अभिव्यक्ति अपरिहार्य व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की संरचना अस्पष्ट और एक GAL4 ड्राइवर लाइन ब्याज की एक विशेष न्यूरॉन में अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए उपलब्ध नहीं हो सकता है. (MARCM एक प्रतिनिधि के साथ मोज़ेक विश्लेषणressible सेल मार्कर) 8 विधि व्यक्तिगत स्तर पर सेल अनिवार्य रूप से किसी भी न्यूरॉन की लेबलिंग, लेकिन और GAL80 प्रोटीन की धीमी गति से कारोबार की वजह से जल्दी लार्वा भ्रूण में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया नहीं कर सकते हैं प्रदान कर सकते हैं.
आनुवंशिक लेबलिंग की इन सीमाओं को देखते हुए, हम मानते हैं कि ड्रोसोफिला भ्रूण में न्यूरॉन डाई इंजेक्शन एक मूल्यवान तकनीक बनी हुई है और व्यापक आवेदन मिलना चाहिए. इस लक्ष्य को बढ़ावा देने के लिए, हम यहाँ विधि का विस्तृत विवरण उपलब्ध कराते हैं. अपनी शक्ति का एक उदाहरण हमारे देर ड्रोसोफिला 14 भ्रूण के पेट neuromeres में interneurons का पूरा सेट की आकारिकी की हाल ही में खाते द्वारा प्रदान की जाती है. इस अध्ययन है, जो व्यक्ति neuronal सेल प्रकार के दोनों morphological परिवर्तनशीलता और भ्रूण के CNS में neuromere संगठन के सिद्धांतों से पता चला किसी भी वर्तमान में उपलब्ध अन्य लेबलिंग विधि के साथ संभव नहीं होता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
ड्रोसोफिला की एक मॉडल प्रणाली के रूप में एक बड़ा लाभ यह है कि यह और एकल कक्षों के स्तर पर विकास कार्य के विश्लेषण की अनुमति देता है. यह विशेष रूप से तंत्रिका तंत्र, जहां सेल प्रकार की विविधता असाधारण ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम GMT DFG से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth | 4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.
Riferimenti
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