وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em> ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em
Summary
نقدم تقنية الخلايا العصبية لوصفها واحد في الجهاز العصبي المركزي (CNS) من<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة، والذي يسمح تحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية من قبل أي من الضوء المرسل أو المجهري متحد البؤر.
Abstract
في هذه المادة ونحن تصف كيفية تسمية فردي الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الجنينية من ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا عن طريق الحقن juxtacellular من محبة للدهون الفلورسنت الغشاء علامة مبادرة ديزرتك الصناعية. هذا الأسلوب يسمح للتصور شكل الخلية العصبية بقدر كبير من التفصيل. فمن الممكن لتسمية أي خلية في الجهاز العصبي المركزي: أجسام الخلايا من الخلايا العصبية المستهدفة هي تصور البصريات تحت DIC أو عن طريق التعبير عن علامة وراثية الفلورسنت مثل GFP. بعد وضع العلامات، يمكن أن تتحول إلى مبادرة ديزرتك الصناعية إلى البني وصمة عار دائمة من قبل photoconversion للسماح التصور من شكل الخلية مع الضوء والبصريات المنقولة DIC. وبدلا من ذلك، يمكن ملاحظة الخلايا مبادرة ديزرتك الصناعية التي تحمل علامات مباشرة مع المجهري متحد البؤر، مما يمكن من عرض وراثيا colocalised البروتينات الفلورية مراسل. ويمكن استخدام هذه التقنية في أي حيوان، بغض النظر عن التركيب الوراثي، مما يجعل من الممكن لتحليل الظواهر متحولة في قرار خلية واحدة.
Introduction
مورفولوجيا الخلايا العصبية المعرفة على مستوى الخلايا الفردية شرطا مسبقا أساسيا لفهم وظيفة الخلايا العصبية والاتصال CNS. وهكذا، منذ الأيام الأولى لعلم الأعصاب، وسعى الباحثون لتطوير أساليب التصنيف واحد الخلية (انظر 7 لعلاج التاريخية لهذه المسألة). الطرق التقليدية مثل تلطيخ جولجي تقديم قرار ممتاز من مورفولوجيا الخلايا العصبية ولكن ليست مناسبة إذا كان أحد يسعى لتسمية نوع معين من الخلايا العصبية بطريقة موجهة، وتلطيخ يحدث بطريقة عشوائية. تناولت تطوير أساليب لتلطيخ الخلايا واحدة عن طريق الحقن داخل الخلايا أو juxtacellular من الأصباغ من مسرى مكروي شرط وضع العلامات المحددة.
تقديم الطلب من واحد حقن صبغة الخلايا العصبية لذبابة الفاكهة تحديا كبيرا، نظرا لصغر حجم الكائن الحي على حد سواء والخلايا العصبية لها. ومع ذلك، وتلطيخ الخلايا العصبية الجنينية واحدة من ذبابة الفاكهة </emوقد تحقق> الخلايا العصبية في منتصف 1980s في مختبر كوري جودمان 15. في حين أن طريقة كانت مفيدة بارز وقدم بعض الأفكار الرئيسية في آليات للتنمية الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة على مدى 20-30 سنة الماضية (على سبيل المثال 2، 10)، وقد أحجم العديد من العمال بعيدا عن ذلك، إلى حد كبير بسبب مطالبها الفنية.
وقد ساهم توفر في السنوات الأخيرة من التقنيات الوراثية لوضع العلامات العصبية في ذبابة الفاكهة أيضا إلى عدم شعبية واحدة حقن الخلايا العصبية صباغة. يمكن التعبير GAL4 الموجهة من يبني GFP غشاء المستهدفة توفير تحليل ممتاز من التشكل العصبية 1، 20. ومع ذلك، فإن هذا الأسلوب له بعض القيود: التعبير غالبا ما لا مفر منه من GFP في خلايا متعددة يمكن أن يحجب هيكل الخلايا العصبية الفردية وخط سائق GAL4 قد لا تكون متاحة لدفع التعبير في الخلايا العصبية خاصة في المصالح. وMARCM (تحليل الفسيفساء مع معدل تقييميمكن ressible ماركر الخليوي) الطريقة 8 من الخلايا العصبية وصفها توفير أي أساسا على مستوى خلية واحدة، ولكن لا يمكن استخدامها بنجاح في وقت مبكر الجنين واليرقة بسبب بطء دوران من البروتين GAL80.
ونظرا لهذه القيود لوضع العلامات الوراثية، ونحن نعتقد أن الخلايا العصبية صبغة واحدة حقن الجنين في ذبابة الفاكهة لا تزال تقنية قيمة وتستحق أوسع التطبيق. لتعزيز هذا الهدف، ونحن نقدم هنا وصفا مفصلا للأسلوب. وتقدم مثالا للقوة من قبل حسابنا الأخير للمورفولوجية مجموعة كاملة من interneurons في neuromeres البطن من الجنين ذبابة الفاكهة أواخر 14. وهذه الدراسة التي كشفت كل من تقلب المورفولوجية من أنواع الخلايا العصبية الفردية ومبادئ منظمة قسيم عصبي في الجهاز العصبي المركزي للجنين، لم يكن ممكنا مع أي وسيلة أخرى وضع العلامات المتاحة حاليا.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحد الميزة الرئيسية لذبابة الفاكهة كنظام نموذج هو أنه يتيح تحليل التنمية وظيفة على مستوى الخلايا واحدة. هذا مفيد خصوصا فيما يتعلق الجهاز العصبي، حيث تنوع أنواع الخلايا عالية بشكل استثنائي وظيفة ومورفولوجيا الخلايا المجاورة يمكن أن تكون مختلفة تماما.
<p class="jo…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من DFG لGMT
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth | 4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.
Riferimenti
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Biologia dello sviluppo. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
