Labeling van afzonderlijke cellen in het centrale zenuwstelsel van<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

We een techniek voor etikettering enkele neuronen in het centrale zenuwstelsel (CNS) van<em> Drosophila</em> Embryo's die de analyse van neuronale morfologie door een doorvallend licht of confocale microscopie mogelijk.

Abstract

In dit artikel beschrijven we hoe u individueel neuronen in de embryonale CZS van Drosophila melanogaster door juxtacellular injectie van de lipofiele fluorescente membraan merker Dil labelen. Deze methode maakt het mogelijk de visualisatie van de neuronale celmorfologie in groot detail. Het is mogelijk om een ​​cel label in het CZS: cellichamen van neuronen doelwit zichtbaar gemaakt onder DIC optiek of door expressie van een fluorescente genetische merker zoals GFP. Na etikettering, de Dil worden omgezet in een permanente bruine vlek door fotoconversie tot visualisatie van celmorfologie toe met doorvallend licht en DIC optiek. Als alternatief kan de DiI gemerkte cellen direct worden waargenomen met confocale microscopie, waardoor genetisch geïntroduceerd fluorescerende reporter eiwitten worden colocalised. De techniek kan worden gebruikt in een dier, ongeacht het genotype, waardoor het mogelijk mutant fenotype analyseren cel resolutie.

Introduction

Kennis van neuronale morfologie op het niveau van individuele cellen is een belangrijke voorwaarde voor het begrijpen van neuronale connectiviteit en CZS-functie. Zo vanaf de vroegste dagen van de neurowetenschappen, hebben onderzoekers getracht enkele cel etikettering technieken (zie ⁷ voor een historische behandeling van deze kwestie) te ontwikkelen. Klassieke methoden, zoals Golgi kleuring geven uitstekende resolutie van neuronale morfologie maar zijn niet geschikt als men streeft naar een bepaald type neuron label in het gericht, zoals kleuring optreedt op een willekeurige manier. De ontwikkeling van methoden voor het beitsen van enkele cellen door intracellulaire of juxtacellular injectie van kleurstoffen uit een micro-elektrode in op de eis van specifieke etikettering.

De toepassing van enkelvoudige neuron kleurstof injectie Drosophila een belangrijke uitdaging, vanwege de kleine afmetingen van zowel het organisme en de neuronen. Niettemin enkel neuron kleuring van embryonale Drosophila </em> Neuronen werd bereikt in het midden van de jaren 1980 in het laboratorium van Corey Goodman ^15. Terwijl de methode is bij uitstek nuttig en heeft een aantal belangrijke inzichten in de mechanismen voor neuronale ontwikkeling in Drosophila in de afgelopen 20-30 jaar (bv ^{2, 10),} hebben veel werknemers teruggeschrokken van het, grotendeels als gevolg van de technische eisen.

De beschikbaarheid in meer recente jaren van genetische technieken voor neuronale etikettering in Drosophila heeft ook bijgedragen aan de impopulariteit van enkel neuron kleurstof injectie. GAL4-gerichte expressie van membraan gerichte GFP constructen kunnen uitstekende resolutie van neurale morfologie ^{1, 20.} Deze methode heeft bepaalde beperkingen: de vaak onvermijdelijk expressie van GFP in meerdere cellen kan de structuur van individuele neuronen verhullen en een GAL4 rijders niet beschikbaar voor expressie in een bepaald neuron plaats. De MARCM (Mosaic Analyse met een Repressible Cell Marker) methode ⁸ kan coderen van in wezen elke neuron op individueel celniveau, maar niet met succes worden gebruikt in de embryo en vroege larve vanwege de lage omzet van de GAL80 eiwit.

Gezien deze beperkingen van genetische kenmerken wij dat enkel neuron kleurstof injectie in de Drosophila embryo een waardevol techniek en verdient bredere toepassing. Om dit doel te bevorderen, wij hier een gedetailleerde beschrijving van de werkwijze. Een illustratie van het vermogen geleverd door onze recente houden met de morfologie van de benodigde interneuronen in abdominale neuromeres de late Drosophila embryo ^14. Deze studie, die zowel de morfologische variabiliteit van individuele neuronale celtypen en de beginselen van neuromere organisatie in het CZS van de embryo geopenbaard, zou niet mogelijk zijn geweest met andere momenteel beschikbare labelingsmethode.

Protocol

We hebben gebruik gemaakt van twee enigszins verschillende varianten van de enkel neuron etikettering methode in onze laboratoria. De verschillen hebben betrekking op de embryo's worden verzameld, dechorionisation, devitellinisation en embryo fileren stappen. Figuur 1 geeft een overzicht van de gemeenschappelijke en divergerende stappen van de varianten. 1. Voorbereiding van micro-naalden voor Embryo Dissection en Micropipetten Dye Injectie Glas naalden voor e…

Representative Results

Figuur 4 toont typische resultaten van de techniek, de hier beschreven. Figuur 4A toont een voorbeeld van een gevulde DiI enkele interneuron dat zuiver was photoconverted. Het toont mooi de mate van detail deze voorbereidingen aanbod. Wanneer bekeken onder DIC optiek de ruimtelijke context van de gemerkte cel in de niet-gemerkte omringende weefsel zichtbaar wordt, bijvoorbeeld de positie van het cellichaam in de cortex en de vezels in de projectie neuropile. <p class="jove_…

Discussion

Een groot voordeel van Drosophila als model is dat het onderzoek van de ontwikkeling en functie van het niveau van afzonderlijke cellen mogelijk maakt. Dit is vooral handig over het zenuwstelsel, waar de diversiteit van celtypen uitzonderlijk hoog en de werking en vorm van naburige cellen kan heel anders.

De werkwijze die we hier kunnen de kenmerken van individuele neuronen met een kleurstof die kan worden omgezet in een permanente vlek of rechtstreeks onderzocht door fluorescentie …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
			REAGENTS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde	Merck Millipore		7,4 % in PBS
Glycerol	Roth	3783	70% in PBS
Heptane Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPMENT
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2	to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	to perform the labelings
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecting Microscope	Leica	MZ8	to prepare and disect embryos
Flat Capillaries	Hilgenberg		outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries	Science Products	GB 100 TF 8P
Micromanipulator R	Leica		to perform the labelings
Model P-97	Sutter Instruments		to pull capillaries
Object Slides	Marienfeld Superior	1000000
Scientific Microscope	Zeiss	Axioskop 2 mot	to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope	Olympus	BX50	to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	to record labelings after photoconversion

Table 1.